Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo
Summary
We beschrijven een protocol voor de chemische conjugatie van het modelantigeen ovalbumine naar een endocytosereceptorspecifiek antilichaam voor in vivo dendritische celtargeting. Het protocol omvat zuivering van het antilichaam, chemische conjugatie van het antigeen, evenals zuivering van het conjugaat en de verificatie van efficiënte conjugatie.
Abstract
Gerichte antigeenafgifte aan cross-presenterende dendritische cellen (DC) in vivo induceert efficiënt T-effectorcelresponsen en toont een waardevolle benadering in vaccinontwerp. Antigeen wordt aan DC geleverd via antilichamen die specifiek zijn voor endocytosereceptoren zoals DEC-205 die opname, verwerking en MHC klasse I- en II-presentatie induceren.
Efficiënte en betrouwbare conjugatie van het gewenste antigeen naar een geschikt antilichaam is een cruciale stap in DC-targeting en hangt onder andere af van het formaat van het antigeen. Chemische conjugatie van eiwit over de volledige lengte naar gezuiverde antilichamen is een mogelijke strategie. In het verleden hebben we met succes cross-linking vastgesteld van het modelantigeen ovalbumine (OVA) en een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) voor in vivo DC-targetingstudies bij muizen. De eerste stap van het protocol is de zuivering van het antilichaam uit het supernatant van de NLDC (non-lymphoid dendrittic cells)-145 hybridoma door affiniteitschromatografie. Het gezuiverde antilichaam wordt geactiveerd voor chemische conjugatie door sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat) terwijl tegelijkertijd de sulfhydryl-groepen van het OVA-eiwit worden blootgesteld door incubatie met TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Overtollige TCEP-HCl en sulfo-SMCC worden verwijderd en het antigeen wordt gemengd met het geactiveerde antilichaam voor nachtelijke koppeling. Het resulterende αDEC-205/OVA-conjugaat is geconcentreerd en bevrijd van ongebonden OVA. Succesvolle conjugatie van OVA naar αDEC-205 wordt geverifieerd door western blot-analyse en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We hebben met succes chemisch gekruist αDEC-205/OVA gebruikt om cytotoxische T-celresponsen in de lever te induceren en om verschillende adjuvantia te vergelijken op hun potentieel bij het induceren van humorale en cellulaire immuniteit na in vivo targeting van DEC-205+ DC. Daarnaast bieden dergelijke chemisch gekoppelde antilichaam / antigeenconjugaten waardevolle hulpmiddelen voor de efficiënte inductie van vaccinresponsen op tumorantigenen en is bewezen superieur te zijn aan klassieke immunisatiebenaderingen met betrekking tot de preventie en therapie van verschillende soorten tumoren.
Introduction
Dendritische cellen (DC) zijn centrale spelers van het immuunsysteem. Ze zijn een diverse groep cellen gespecialiseerd in antigeen-presentatie en hun belangrijkste functie is het overbruggen van aangeboren en adaptieve immuniteit1,2. Belangrijk is dat DC niet alleen een belangrijke rol speelt bij efficiënte en specifieke pathogeengerichte reacties, maar ook betrokken is bij vele aspecten van antitumorimmuniteit1,3.
Vanwege hun exclusieve rol in gastheerimmuniteit kwam DC in beeld als doelcellen voor vaccinatie4. Een benadering is om antigenen in vivo op DC te richten om antigeenspecifieke immuunresponsen te induceren en in de afgelopen jaren is een groot aantal studies gewijd aan het definiëren van geschikte receptoren en targetingstrategieën1,4. Een voorbeeld is de C-type lectinereceptor DEC-205, die kan worden aangevallen door DEC-205-specifieke antilichamen om endocytose te induceren. Belangrijk is dat dec-205-targeting in combinatie met geschikte adjuvantia efficiënt langlevende en beschermende CD4+ en CD8+ T-cellen induceert, evenals antilichaamresponsen, ook tegen tumorantigenen3,5,6,7,8,9.
Er zijn een aantal studies die aantonen dat geconjugeerde antigenen gericht op DC superieur zijn aan vrij niet-geconjugeerd antigeen3,5,10,11,12. Dit maakt de vervoeging van het antigeen met het respectieve DC-targetinggedeelte een centrale stap in DC-targetingbenaderingen. In het geval van DC-targeting via antilichamen of antilichaamfragmenten kunnen antigenen chemisch of genetisch verbonden zijn en beide strategieën bieden hun eigen (dis)voordelen1. Aan de ene kant is er in genetisch gemanipuleerde antilichaam-antigeenconstructies een controle over de antigeendosis en de locatie die superieure vergelijkbaarheid tussen loten1biedt . Tegelijkertijd heeft chemische conjugatie echter minder voorbereiding nodig en biedt het meer flexibiliteit, vooral bij het testen en vergelijken van verschillende antigenen en / of vaccinatiestrategieën in experimentele en preklinische modellen.
Hier presenteren we een protocol voor de efficiënte en betrouwbare chemische conjugatie van ovalbumine (OVA) als modeleiwitantigeen tegen een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) geschikt voor in vivo DC-targeting bij muizen. Ten eerste wordt αDEC-205 gezuiverd uit NLDC-145 hybridomacellen13. Voor chemische conjugatie wordt de heterobifunctionele crosslinker sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC), die NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- en maleimidegroepen bevat, gebruikt, waardoor covalente conjugatie van amine- en sulhydrylbevattende moleculen mogelijk is. In het bijzonder reageren de primaire amines van het antilichaam in eerste instantie met sulfo-SMCC en de resulterende maleimide-geactiveerde αDEC-205 reageert vervolgens met het sulfhydryl-bevattende OVA-eiwit gereduceerd door TCEP-HCl (Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Het eindproduct is chemisch geconjugeerd αDEC-205/OVA(figuur 1). Naast chemische conjugatie zelf, beschrijft ons protocol de verwijdering van overtollige OVA uit het conjugaat, evenals de verificatie van succesvolle conjugatie door middel van western blot-analyse en een specifieke enzymgebonden immunosorbent-assay. We hebben deze aanpak in het verleden met succes toegepast om OVA en andere eiwitten of immunogene peptiden chemisch te conjugeren aan αDEC-205. We tonen efficiënte binding aan CD11c+ cellen in vitro, evenals de efficiënte inductie van cellulaire en humorale immuniteit in vivo.
Zeker, er zijn nadelen aan deze methode, zoals in lot-to-lot vergelijkbaarheid en in de exacte dosering van het antigeen binnen het uiteindelijke geconjugeerde. Niettemin biedt chemische conjugatie experimentele flexibiliteit in de keuze van het antilichaam en het eiwitantigeen in vergelijking met genetisch gemanipuleerde constructies. Daarom geloven we dat deze aanpak vooral waardevol is bij het evalueren van verschillende antigenen voor hun efficiëntie in DC-targeting in preklinische muismodellen, belangrijk ook in de context van specifieke antitumor immuunresponsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemische conjugatie van een endocytosereceptorspecifiek antilichaam en een eiwitantigeen biedt een efficiënte en, belangrijker nog, ook flexibele aanpak voor in vivo DC-targeting in preklinische muismodellen. Met ons protocol bieden we een efficiënte aanpak voor de succesvolle conjugatie van het modelantigeen OVA naar een DEC-205-specifiek IgG-antilichaam.
In ons protocol wordt αDEC-205 gezuiverd uit een hybridoma cellline en in het verleden hebben we het antilichaam gezuiverd met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken S. Prettin voor deskundige technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) die werd verstrekt als onderdeel van de Helmholtz Alliance ”Immunotherapy of Cancers” (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
