インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合
Summary
インビボ樹状細胞標的に対するエンドサイトーシス受容体特異的抗体に対するモデル抗原オボアルブミンの化学的結合のためのプロトコルについて説明する。プロトコルには、抗体の精製、抗原の化学的共役、ならびにコンジュゲートの精製および効率的な共役の検証が含まれる。
Abstract
生体 内で クロスプレゼンテ提示樹状細胞(DC)への標的抗原送達は、Tエフェクター細胞応答を効率的に誘導し、ワクチン設計において価値のあるアプローチを示す。抗原は、取り込み、処理、およびMHCクラスI-およびII-プレゼンテーションを誘導するDEC-205などのエンドサイトーシス受容体に特異的な抗体を介してDCに送達される。
適切な抗体に対する望ましい抗原の効率的かつ確実な結合は、DC標的化における重要なステップであり、他の要因の中でも抗原の形式に依存する。精製抗体に対する全長タンパク質の化学的結合は、考えられる1つの戦略である。これまで、マウスでの インビボ DC標的化研究に対して、モデル抗原オボアルブミン(OVA)とDEC-205特異的IgG2a抗体(αDEC-205)の架橋の確立に成功しました。プロトコルの最初のステップは、アフィニティークロマトグラフィーによるNLDC(非リンパ系樹状細胞)-145ハイブリドーマの上清からの抗体の精製である。精製された抗体は、スルホ-SMCC(スルホフチニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシル酸)によって化学的共役のために活性化されると同時に、OVAタンパク質のスルフヒドリル基はTCEP-HCl(トリス(トリス(トリス(トリス(2-カルボシテヒリル)ホドロフェでインビクテーションを介して露出する。過剰なTCEP-HClおよびスルホ-SMCCは除去され、抗原は一晩の結合のために活性化された抗体と混合される。得られたαDEC-205/OVAコンジュゲートは濃縮され、非結合OVAから解放される。αDEC-205へのOVAの結合に成功した結合は、ウェスタンブロット分析および酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって検証される。
我々は、化学的に架橋されたαDEC-205/OVAを使用して、肝臓で細胞傷害性T細胞応答を誘導し、DEC-205+DCの生体内標的化後に体液性および細胞性免疫を誘導する可能性について異なるアジュバントを比較することに成功した。それ以上に、このような化学的結合抗体/抗原コンジュゲートは、腫瘍抗原に対するワクチン応答の効率的な誘導のための貴重なツールを提供し、様々なタイプの腫瘍の予防および治療に関する古典的な免疫化アプローチよりも優れていることが証明されています。
Introduction
樹状細胞(DC)は免疫系の中心的なプレーヤーである。彼らは抗原提示に特化した多様な細胞群であり、その主要な機能は、自然免疫と適応免疫1、2を橋渡しすることである。重要なことに、DCは効率的かつ特異的な病原体指向応答において重要な役割を果たすだけでなく、抗腫瘍性免疫1、3の多くの側面にも関与している。
宿主免疫における排他的な役割のために、DCはワクチン接種4の標的細胞として焦点を当てた。一つのアプローチは、抗原特異的免疫応答を誘導するために生体内でDCに抗原を標的にするものであり、そして過去数年間にわたり、多くの研究が適切な受容体および標的戦略1、4を定義することに専念してきた。その一例が、C型レクチン受容体DEC-205であり、これは、エンドサイトーシスを誘導するためにDEC-205特異的抗体によって標的とすることができる。重要なことに、適切なアジュバントとの組み合わせにおけるDEC-205の標的化は、長期かつ保護的なCD4+およびCD8+T細胞、ならびに抗体応答を効率よく誘導することが示されており、腫瘍抗原3、5、6、7、8、9にも対しても。
DCを標的とする共役抗原が遊離非共役抗原3、5、10、11、12よりも優れているという多数の研究がある。これにより、それぞれのDCターゲティング部分への抗原の結合がDCターゲティングアプローチの中心的なステップとなる。抗体または抗体断片を介してDC標的化する場合、抗原は化学的または遺伝的に結合することができ、かついずれかの戦略は、独自の(dis)利点1を提供する。一方で、遺伝子組み換え抗体抗原構築物では、抗原用量の制御と、ロット1間の優れた比較性を提供する場所がある。しかし同時に、化学結合は、実験モデルおよび前臨床モデルで異なる抗原および/またはワクチン接種戦略をテストおよび比較しようとする場合に特に、より少ない準備を必要とし、より柔軟性を提供します。
ここでは、マウスでのインビボDC標的化に適したDEC-205特異的IgG2a抗体(αDEC-205)に対するモデルタンパク質抗原としてのオボアルブミン(OVA)の効率的かつ信頼性の高い化学的結合のためのプロトコルを提示する。まず、αDEC-205は、NLDC-145ハイブリドーマ細胞13から精製される。化学共役には、NHS(N-ヒドロキシスクイミド)エステルおよびマレイミド基を含むヘテロビテレンティクロスリンカースルフォスチーニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sulfo-SMCC)が使用され、アミンおよびスルフシルヒドロを含む分子の共有結合が可能である。具体的には、抗体の一次アミンはスルホ-SMCCと最初に反応し、得られたマレイミド活性化αDEC-205は、TCEP-HCl(Tris(2-カルボクセチル)塩酸塩を介して還元されたスルフヒドリル含有OVAタンパク質と反応する。最終製品は化学的に共役したαDEC-205/OVA(図1)です。化学共役自体を超えて、我々のプロトコルは、結合物からの過剰なOVAの除去、ならびにウェスタンブロット分析および特定の酵素結合免疫吸着アッセイによる正常な結合の検証を記述する。過去にこのアプローチを採用し、OVAや他のタンパク質や免疫原性ペプチドをαDEC-205に化学的に結合しました。我々は、インビトロでCD11c+細胞への効率的な結合、ならびに生体内での細胞および体液性免疫の効率的な誘導を実証する。
確かに、この方法には、ロット間の比較性や最終コンジュゲート内の抗原の正確なドージングなど、欠点があります。しかしながら、化学的結合は、遺伝子組み換え構造と比較して、抗体およびタンパク質抗原の選択において実験的な柔軟性を提供する。したがって、このアプローチは、特に、特定の抗腫瘍性免疫応答の文脈においても、前臨床マウスモデルにおけるDC標的化におけるそれらの効率について異なる抗原を評価する上で特に価値があると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
エンドサイトーシス受容体特異的抗体およびタンパク質抗原の化学的結合は、前臨床マウスモデル におけるインビボ DCターゲティングに対する効率的かつ、重要な、柔軟なアプローチを提供する。我々のプロトコルにより、モデル抗原OVAをDEC-205特異的IgG抗体にうまく結合するための効率的なアプローチを提供します。
本プロトコルでは、αDEC-205はハイブリドーマ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、専門家の技術支援のためにS.プレッティンに感謝します。この研究は、ヘルムホルツ同盟の「がんの免疫療法」(HCC_WP2b)の一環として提供されたドイツ研究センターヘルムホルツ協会(HGF)の助成金によって支えられた。
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
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