הטיות כימיות של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים של עכבר במבחנה וב- In Vivo
Summary
אנו מתארים פרוטוקול להטיה הכימית של המודל אנטיגן אובלבומין לנוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס עבור פילוח תאים דנדריטיים של ויוו. הפרוטוקול כולל טיהור של הנוגדן, הטיות כימיות של האנטיגן, כמו גם טיהור של ההצומדת ואימות ההטיות היעילות.
Abstract
אספקת אנטיגן ממוקדת לתאים דנדריטיים (DC) המציגים באופן צולב ב-vivo גורמת ביעילות לתגובות תאי אפקט T ומציגה גישה בעלת ערך בעיצוב החיסון. אנטיגן מועבר ל- DC באמצעות נוגדנים ספציפיים לקולטני אנדוציטוזיס כגון DEC-205 הגורמים לספיגה, עיבוד ו- MHC Class I- ו- II- presentation.
הטיות יעילות ואמינות של האנטיגן הרצוי לנוגדן מתאים הוא צעד קריטי בפילוח DC ובין היתר תלוי בפורמט האנטיגן. הטיות כימיות של חלבון באורך מלא לנוגדנים מטוהרים היא אסטרטגיה אפשרית אחת. בעבר, הקמנו בהצלחה קישור צולב של המודל אנטיגן אובלבומין (OVA) ונוגדן IgG2a ספציפי DEC-205 (αDEC-205) למחקרי מיקוד in vivo DC בעכברים. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא טיהור הנוגדן מן supernatant של NLDC (תאים דנדריטיים שאינם לימפואידים)-145 hybridoma על ידי כרומטוגרפיה זיקה. הנוגדן המטוהר מופעל להטיה כימית על ידי סולפו-SMCC (סולפוסוקינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] ציקלוהקסן-1-קרבוקסילאט) ובמקביל קבוצות סולפיהידיל של חלבון OVA נחשפות באמצעות דגירה עם TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין הידרוכלוריד). עודף TCEP-HCl וסולפו-SMCC מוסרים והאנטיגן מעורבב עם הנוגדן הפעיל לצימוד בן לילה. αDEC-205/OVA מצומדת ומשוחררת מ-OVA לא מאוגד. הטיות מוצלחות של OVA ל- αDEC-205 מאומתת על ידי ניתוח כתם מערבי ובוחן חיסוני הקשור לאנזים (ELISA).
השתמשנו בהצלחה αDEC-205/OVA מוצלב כימית כדי לגרום לתגובות תאי T ציטוטוקסיות בכבד ולהשוות אדג’ובנטים שונים לפוטנציאל שלהם לגרום לחסינות הומוריסטית ותאית בעקבות פילוח vivo של DEC-205+ DC. מעבר לכך, הצמדי נוגדנים/אנטיגן בעלי זיקה כימית אלה מציעים כלים בעלי ערך לגיוס יעיל של תגובות חיסון לאנטיגנים של הגידולים והוכחו כנעלים על גישות חיסון קלאסיות בנוגע למניעה וטיפול בסוגים שונים של גידולים.
Introduction
תאים דנדריטיים (DC) הם שחקנים מרכזיים של המערכת החיסונית. הם קבוצה מגוונת של תאים המתמחים אנטיגן-מצגת ותפקידם העיקרי הוא לגשרחסינות מולדתאדפטיבית1,2. חשוב לציין, DC לא רק לשחק תפקיד חשוב בתגובות יעילות וספציפליות פתוגן, אלא גם מעורבים בהיבטים רבים של חסינות antitumor1,3.
בשל תפקידם הבלעדי בחסינות המארחת, DC נכנסה לפוקוס כתאי יעד לחיסון4. גישה אחת היא למקד אנטיגנים לוושינגטון ב- vivo כדי לגרום לתגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן ובשנים האחרונות, מספר רב של מחקרים הוקדשו להגדרת קולטנים מתאימים ואסטרטגיות מיקוד1,4. דוגמה אחת היא קולטן לציטין מסוג C DEC-205, אשר יכול להיות ממוקד על ידי נוגדנים ספציפיים DEC-205 כדי לגרום אנדוציטוזיס. חשוב לציין, פילוח DEC-205 בשילוב עם אדג’ובנטים מתאימים הוכח כמזינה ביעילות CD4+ ו- CD8+ T, כמו גם תגובות נוגדנים, גם נגד אנטיגנים גידול3,5,6,7,8,9.
ישנם מספר מחקרים המראים אנטיגנים מצומדים המיועדים לוושינגטון להיות עדיפים על אנטיגן חינם לא מצומד3,5,10,11,12. זה הופך את ההטיה של האנטיגן לוושינגטון בהתאמה מיקוד moiety צעד מרכזי בגישות מיקוד DC. במקרה של מיקוד DC באמצעות נוגדנים או שברי נוגדנים, אנטיגנים יכולים להיות מקושרים כימית או גנטית וכל אסטרטגיה מספקת יתרונות משלה(dis)1. מצד אחד, במבנים נוגדנים אנטיגן מהונדסים גנטית יש שליטה על מינון האנטיגן, כמו גם את המיקום המספק השוואה מעולה בין מגרשים1. יחד עם זאת, הטיות כימיות זקוקות לפחות הכנה ומספקת גמישות רבה יותר במיוחד כאשר מנסים לבדוק ולהשוות אנטיגנים שונים ו / או אסטרטגיות חיסון במודלים ניסיוניים ופרה קליניים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להטיה כימית יעילה ואמינה של אובלבומין (OVA) כאנטיגן חלבון מודל לנוגדן IgG2a ספציפי ל- DEC-205 (αDEC-205) המתאים למיקוד ב- vivo DC בעכברים. ראשית, αDEC-205 מטוהר מתאי היברידיומה NLDC-14513. עבור הטיות כימיות, נעשה שימוש באיתרונים הטרוביפונקטוריים סולפוסוצינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-קרבוקסילאט (סולפו-SMCC), המכיל קבוצות אסתר ומליימיד NHS (N-הידרוקסיסוצינימיד), המאפשר הטיות קוולנטיות של מולקולות המכילות אמין וגופריתיל. באופן ספציפי, האמינים העיקריים של הנוגדן מגיבים בתחילה עם סולפו-SMCC וכתוצאה מכך מופעל maleimide αDEC-205 ואז מגיב עם חלבון OVA המכיל סולפיהידיל מופחת באמצעות TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) הידרוכלוריד). המוצר הסופי הוא מצומד כימית αDEC-205/OVA(איור 1). מעבר להטיה הכימית עצמה, הפרוטוקול שלנו מתאר הסרה של עודף OVA מההצמדה, כמו גם אימות של הטיות מוצלחות באמצעות ניתוח כתם מערבי וביטול חיסוני ספציפי הקשור לאנזים. השתמשנו בהצלחה בגישה זו בעבר כדי להטות כימית OVA וחלבונים אחרים או פפטידים אימונוגניים ל αDEC-205. אנו מפגינים קשירה יעילה ל- CD11c+ תאים במבחנה, כמו גם אינדוקציה יעילה של חסינות תאית והומוריסטית ב- vivo.
אין ספק, ישנם חסרונות לשיטה זו כגון השוואת הרבה למגרש ובמינון המדויק של האנטיגן בתוך ההסתה הסופית. עם זאת, הטיות כימיות מספקות גמישות ניסיונית בבחירת הנוגדן ואנטיגן החלבון בהשוואה למבנים מהונדסים גנטית. לכן, אנו מאמינים שגישה זו חשובה במיוחד בהערכת אנטיגנים שונים ליעילותם ב- DC פילוח במודלים של עכברים פרה-קליניים, וחשוב גם בהקשר של תגובות חיסוניות אנטי-אטומיות ספציפיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטיות כימיות של נוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס ואנטיגן חלבונים מספקות גישה יעילה, וחשובה, גם גמישה עבור in vivo DC פילוח במודלים עכבר פרה קליני. עם הפרוטוקול שלנו אנו מספקים גישה יעילה להטיה מוצלחת של מודל אנטיגן OVA לנוגדן IgG ספציפי DEC-205.
בפרוטוקול שלנו, αDEC-205 מטוהר מקו התא ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לס. פרטין על הסיוע הטכני המומחה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של איגוד הלמהולץ של מרכזי מחקר גרמניים (HGF) שניתן כחלק מברית הלמהולץ ‘אימונותרפיה של סרטן’ (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines–hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans’ cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
