Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo
Summary
Descrevemos um protocolo para a conjugação química do modelo de ovalbumin de antígeno para um anticorpo específico do receptor de endocitose para o direcionamento de células dendríticas in vivo. O protocolo inclui a purificação do anticorpo, a conjugação química do antígeno, bem como a purificação do conjugado e a verificação de uma conjugação eficiente.
Abstract
A entrega de antígenos direcionados para células dendríticas de apresentação cruzada (DC) in vivo in vivo induz eficientemente as respostas celulares de efeito T e exibe uma abordagem valiosa no design da vacina. O antígeno é fornecido em DC através de anticorpos específicos para receptores de endocitose, como o DEC-205, que induz a captação, processamento e apresentação da classe I e II do MHC.
A conjugação eficiente e confiável do antígeno desejado para um anticorpo adequado é um passo crítico na segmentação dc e, entre outros fatores, depende do formato do antígeno. A conjugação química de proteína de comprimento total para anticorpos purificados é uma estratégia possível. No passado, estabelecemos com sucesso a inter-vinculação do modelo antigen ovalbumin (OVA) e um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) para estudos in vivo DC direcionados em camundongos. O primeiro passo do protocolo é a purificação do anticorpo do supernacante do NLDC (células dendríticas não linfoides)-145 hibrim por cromatografia de afinidade. O anticorpo purificado é ativado para conjugação química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato) enquanto ao mesmo tempo os grupos de sulfhydryl da proteína OVA são expostos através de incubação com TCEP-HCl (tris (tris (2 carboxyethyl). O excesso de TCEP-HCl e sulfo-SMCC são removidos e o antígeno é misturado com o anticorpo ativado para acoplamento durante a noite. O conjugado αDEC-205/OVA resultante é concentrado e liberado de OVA não vinculado. A conjugação bem sucedida de OVA para αDEC-205 é verificada pela análise de manchas ocidentais e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA).
Usamos com sucesso αDEC-205/OVA quimicamente cruzado para induzir respostas de células T citotóxicas no fígado e comparar diferentes adjuvantes para seu potencial em induzir imunidade humoral e celular após o direcionamento vivo do DEC-205+ DC. Além disso, esses conjugados quimicamente acoplados a anticorpos/antígenos oferecem ferramentas valiosas para a indução eficiente das respostas vacinais aos antígenos tumorais e têm sido comprovadamente superiores às abordagens clássicas de imunização em relação à prevenção e terapia de vários tipos de tumores.
Introduction
As células dendríticas (DC) são atores centrais do sistema imunológico. Tratam-se de um grupo diversificado de células especializadas em apresentação de antígenos e sua principal função é fazer a ponte entre imunidade inata e adaptativa1,2. É importante ressaltar que a DC não só desempenha um papel importante em respostas eficientes e específicas dirigidas por patógenos, mas também está envolvida em muitos aspectos da imunidade antitumoral1,3.
Devido ao seu papel exclusivo na imunidade do hospedeiro, a DC entrou em foco como células-alvo paraa vacinação 4. Uma abordagem é direcionar antígenos para DC in vivo para induzir respostas imunes específicas de antígenos e, nos últimos anos, um grande número de estudos tem sido dedicado à definição de receptores adequados e estratégias de segmentação1,4. Um exemplo é o receptor de lectina tipo C DEC-205, que pode ser alvo de anticorpos específicos DEC-205 para induzir a endocitose. É importante ressaltar que o alvo DO DEC-205 na combinação com adjuvantes adequados tem sido mostrado para induzir eficientemente células CD4+ e CD8+ T de longa duração, bem como respostas de anticorpos, também contra antígenos tumorais3,5,6,7,8,9.
Há uma série de estudos que mostram que antígenos conjugados direcionados à DC são superiores ao antígeno não conjugadolivre 3,5,10,11,12. Isso torna a conjugação do antígeno para o respectivo DC visando moiety um passo central nas abordagens de segmentação dc. No caso do direcionamento dc via anticorpos ou fragmentos de anticorpos, os antígenos podem ser quimicamente ou geneticamente ligados e qualquer estratégia fornece suas próprias (des)vantagens1. Por um lado, em construções de anticorpos-antígenos geneticamente modificados há um controle sobre a dose de antígeno, bem como a localização proporcionando comparabilidade superior entre os lotes1. Ao mesmo tempo, no entanto, a conjugação química precisa de menos preparação e proporciona mais flexibilidade especialmente na tentativa de testar e comparar diferentes antígenos e/ou estratégias de vacinação em modelos experimentais e pré-clínicos.
Aqui, apresentamos um protocolo para a conjugação química eficiente e confiável de ovalbumin (OVA) como um antígeno de proteína modelo para um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) adequado para o direcionamento in vivo DC em camundongos. Primeiro, o αDEC-205 é purificado a partir de células hybridoma NLDC-14513. Para conjugação química, é utilizado o sulfosuccinimidil heterobifuncional 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contém os grupos de ester e maleiminimide n-hidroxisuccinimide( N-hidroxisuccinimide), permitindo a conjugação covalente de moléculas de amina e sulfidry-constitucional. Especificamente, as aminas primárias do anticorpo inicialmente reagem com sulfo-SMCC e o αDEC-205 ativado por maleimida resultante, então reage com a proteína OVA contendo sulfidryl reduzida através do CLOP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) cloridrato. O produto final é quimicamente conjugado αDEC-205/OVA (Figura 1). Além da conjugação química em si, nosso protocolo descreve a remoção do excesso de OVA do conjugado, bem como a verificação da conjugação bem sucedida através da análise de manchas ocidentais e um ensaio imunológico específico ligado à enzima. Nós empregamos com sucesso essa abordagem no passado para conjugar quimicamente OVA e outras proteínas ou peptídeos imunogênicos para αDEC-205. Demonstramos vinculação eficiente às células CD11c+ in vitro, bem como a eficiente indução da imunidade celular e humoral in vivo.
Certamente, há desvantagens para este método, como na comparabilidade lot-to-lot e na dosagem exata do antígeno dentro do conjugado final. No entanto, a conjugação química proporciona flexibilidade experimental na escolha do anticorpo e do antígeno proteico em comparação com construções geneticamente modificadas. Portanto, acreditamos que essa abordagem é especialmente valiosa na avaliação de diferentes antígenos para sua eficiência na segmentação dc em modelos pré-clínicos de camundongos, importante também no contexto de respostas imunes antitumorais específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A conjugação química de um anticorpo específico do receptor de endocitose e um antígeno proteico fornece uma abordagem eficiente e, importante, também flexível para o direcionamento in vivo DC em modelos pré-clínicos de camundongos. Com nosso protocolo, fornecemos uma abordagem eficiente para a conjugação bem sucedida do modelo de antígeno OVA a um anticorpo IgG específico DEC-205.
Em nosso protocolo, αDEC-205 é purificado de uma célula híbrida e, no passado, purifica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a S. Prettin pela assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Associação Helmholtz de Centros de Pesquisa Alemães (HGF) que foi fornecida como parte da “Imunoterapia dos Cânceres” da Aliança Helmholtz (HCC_WP2b).
Materials
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 – 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 – 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 – 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 – 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
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