Summary
هنا، نقدم طريقة بسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض حمار وحشي، والتي سوف تسهل التحقيقات في تطور المبيض في حمار وحشي.
Abstract
أصبح حمار وحشي نموذجا مثاليا لدراسة تطور المبيض من الفقاريات. الجريبات هي الوحدة الأساسية للمبيض ، والتي تتكون من البويضات والخلايا الجريبية المحيطة بها. من الضروري فصل كل من الخلايا الجريبية والبويضات لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية ، وتحليل التعبير الجيني ، ونضوج البويضات والإخصاب في المختبر ، إلخ. تستخدم الطريقة التقليدية ملقط لفصل كلا المقصورتين ، وهو أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا ويلحق ضررا كبيرا بالبويضات. هنا، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية سحبت. تحت منظار مجسم ، يمكن فصل البويضات والخلايا الجريبية بسهولة عن طريق الأنابيب في الشعيرات الدموية الزجاجية الدقيقة التي يتم سحبها (يعتمد القطر على قطر الجريب). بالمقارنة مع الطريقة التقليدية، هذه الطريقة الجديدة لديها كفاءة عالية في فصل كل من البويضات والخلايا الجريبية ولها ضرر منخفض للبويضات. والأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة على بصيلات المرحلة المبكرة بما في ذلك في مرحلة ما قبل تكوين الفيتيلوجينيسيس. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات من حمار وحشي.
Introduction
حمار وحشي هو كائن نموذجي رئيسي لدراسة تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء. الحمار الوحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة الآليات الجزيئية لتطوير المبيض1،2،3. يتم الحفاظ على العديد من ملامح تطور المبيض كثيرا خلال التطور من الأسماك إلى الثدييات1،2. على غرار الفقاريات الأخرى ، فإن البالغين حمار وحشي لديهم مبايض غير متزامنة ، تحتوي على بصيلات المبيض لجميع مراحل النمو4. الجريب هو العنصر التناسلي الأساسي للمبيض. تتكون الجريبات من البويضات التي تحيط بها طبقة أو عدة طبقات من الخلايا الجسدية تسمى الخلايا الجريبية. يعتمد تطور الجريبات على الاتصال ثنائي الاتجاه بين البويضات والخلايا الجريبية5. من الضروري فصل الخلايا الجريبية والبويضات عن بصيلات المبيض لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية، وتحليل التعبير الجيني، ونضوج البويضات، والإخصاب في المختبر.
طرق الفصل التقليدية تشمل الفصل الميكانيكي بواسطة ملقط والهضم الأنزيمي6،7،8،9،10. ومع ذلك ، فإن الفصل الميكانيكي عن طريق ملقط يستغرق وقتا طويلا وشاقة. وسوف يسبب أيضا ضررا كبيرا على البويضات أثناء الانفصال. على الرغم من أن طريقة هضم الإنزيم بسيطة للعمل وتتطلب وقتا قصيرا ، إلا أنه يجب التحقق من صحة وقت العلاج وتركيز الإنزيم ، ومعدل سلامة البويضات المعزولة وبقائها ليست مثالية. لذلك، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين في مراحل النمو المختلفة باستخدام أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية المنسحبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي أجريت في تجارب الأسماك تتفق مع لوائح لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات في جامعة نورث ويست العادية.
1. الاستعدادات
- الحيوانات
- استخدام حمار وحشي أنثى بالغة مع طول الجسم من 4-6 سم.
ملاحظة: استخدمنا حمار وحشي من السوق المحلية. - الحفاظ على حمار وحشي في نظام المياه المتداولة مع ضوء 14 ساعة ودورة مظلمة 10 ساعة في حوالي 28 درجة مئوية.
- إطعام الأسماك مرتين يوميا مع الروبيان محلول ملحي فقست حديثا.
- استخدام حمار وحشي أنثى بالغة مع طول الجسم من 4-6 سم.
- سحب الشعيرات الدموية الزجاجية
- استخدام شعيرات زجاجية 15 سم ووضع رأسه في موقد الكحول لتسخينه. عقد نهاية واحدة من الشعيرات الدموية الزجاجية باليد وعقد الطرف الآخر مع ملقط.
- بعد تسخين 5-10 ثانية، والزجاج على النار من الموقد الكحول تصبح حمراء وناعمة. تمتد رأس الشعيرات الدموية الزجاجية مع ملقط لجعل افتتاح الشعرية مع القطر المطلوب.
ملاحظة: القطر يعتمد على أقطار المسام: previtellogenic (PV؛ حوالي 0.30 مم في القطر)، فيتيلوجينيك في وقت مبكر (EV؛ حوالي 0.40 مم في القطر)، midvitellogenic (MV؛ حوالي 0.50 ملم في القطر)، في وقت متأخر vitellogenic (LV؛ حوالي 0.60 ملم في القطر) وكامل نمت ولكن غير ناضجة (FG؛ حوالي 0.65 ملم في القطر). - تمتد فتح الشعيرات الدموية الزجاج إلى القطر المناسب، وهو أصغر قليلا حجم بصيلات منفصلة. لا يمكن للشعيرات الدموية الزجاجية ذات الفتحة الأكبر بكثير من حجم بصيلات المبيض إجراء فصل ، ولكن الأصغر بكثير من شأنه أن يكسر الجريبات أثناء الانفصال. ممارسة تمتد من الشعرية الزجاجية عدة مرات.
ملاحظة: وقت التدفئة يعتمد على حجم الشعيرات الدموية الزجاجية. لا تمتد مباشرة الشعرية الزجاجية على النار من الموقد الكحول. سوف يكسر الشعيرات الدموية الزجاجية. - قطع الشعرية الزجاجية مع قطع أمبولة وكسر الشعرية الزجاجية مع ملقط للحصول على شق سلس.
ملاحظة: فتحة حادة أو مكسورة من الشعرية الزجاجية من شأنه أن يضر بصيلات. - باستخدام أنبوب بلاستيكي طوله 30 سم ، أدخل طرف ماصة 1 مل مع عنصر فلتر في نهاية واحدة ، وأدخل الشعرية الزجاجية المنسحبة في نهاية المصصة ، وربط طرف ماصة 200 ميكرولتر في نهاية أخرى.
2. فصل البويضات حمار وحشي والخلايا الجريبية في مراحل مختلفة
- تشريح المبيض حمار وحشي
- ملء دلو الثلج إلى 4/5 كاملة مع الجليد الطين وإضافة ما يكفي من ماء السمك للسماح الجليد الطين تطفو. الانتظار 2-5 دقائق، والتحقق من درجة حرارة المياه، وتأكد من درجة الحرارة بين 2-4 درجة مئوية.
- تخدير الإناث البالغات عن طريق وضع الأسماك في الماء المثلج لمدة 2-5 دقائق على الأقل، حتى توقف الأسماك حركة الخيشوم. قطع رأس السمكة عن طريق قطع الحبل الشوكي باستخدام مقص حاد لضمان الموت.
- وضع السمك على لوحة تشريح مع ملقط.
- استخدام مقص تشريح لقطع على النحو التالي. تشريح من كلوكا إلى الخياشيم على طول خط الوسط من البطن. قطع من الجزء الخلفي من كلوكا. قطع من الطرف الأمامي إلى الجانب الظهري. إزالة الجلد والعضلات بلطف على جانب واحد من الجسم. فضح الأعضاء الداخلية والخروج من المبيض بأكمله مع ملقط.
- على الفور، ضع المبيضين برفق في طبق ثقافة 100 مم يحتوي على 60٪ من متوسط L-15 (L-15) من Leibovitz.
- عزل بصيلات المبيض
ملاحظة: يستند نظام التدريج الذي اعتمدناه إلى التعريف الأصلي ل Selman et al.4.- عزل بصيلات يدويا من مراحل مختلفة باستخدام زوج من ملقط ناعم كما هو موضح سابقا8.
- تجميع بصيلات المبيض في المراحل التالية: PV، EV، MV، LV و FG مراحل.
- فصل الخلايا الجريبية والبويضات عن بصيلات المبيض
- وضع بصيلات المبيض في مراحل مختلفة في طبق بيتري نظيفة تحتوي على 60٪ L-15 المتوسطة.
- باستخدام الشعرية الزجاجية المنسحبة من الخطوة 1.2 ، تمتص بصيلات في الشعيرات الدموية الزجاجية 2-3 سم وتفجيرها.
ملاحظة: عندما يكون القطر الافتتاحي للشعيرات الدموية الزجاجية مناسبا ، يمكن فصل الجريب عن البويضات عن طريق الاستنشاق مرة واحدة.- إذا تم إرفاق طبقة الخلية الجريبية بالبويضات بقوة ، كرر 2-3 مرات لإنجاز فصل كامل. تجنب محاولات متعددة لإجبار بصيلات من خلال أصغر الشعرية، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الجريب.
ملاحظة: في عملية الاستنشاق والنفخ ، تسقط الطبقة الجريبية وتنفصل عن البويضات ، وأخيرا ، يتم فصل الخلايا الجريبية والبويضات الdenuded(الشكل 1).
- إذا تم إرفاق طبقة الخلية الجريبية بالبويضات بقوة ، كرر 2-3 مرات لإنجاز فصل كامل. تجنب محاولات متعددة لإجبار بصيلات من خلال أصغر الشعرية، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الجريب.
- تجمع البويضات الناضحة ولكن سليمة وجمع البويضات النضحة على قيد الحياة لمزيد من المقايسات.
- للتحقيق فيما إذا كانت الخلايا الجريبية قد فصلت عن الجريبات السليمة، قم بتلطيخ بصيلات سليمة وفصل البويضات ب 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- إصلاح العينات في 4٪ paraformaldehyde المخزنة مؤقتا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة. غسل عدة مرات من قبل برنامج تلفزيوني.
- وصمة عار من قبل DAPI في RT لمدة 30 دقيقة. غسلها عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. عرض وتصوير مع المجهر مضان (على سبيل المثال، لايكا DFC7000 T).
- لتأكيد الفصل المكتمل ، قم بإصلاح الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة في 4٪ paraformaldehyde المخزنة مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، وتضمين وسيط تجميد intissue (على سبيل المثال ، لايكا) عند -25 درجة مئوية.
- قطع الأنسجة الثابتة على microtome، وجبل على الشرائح الزجاجية.
- غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وتصور نواة الخلية مع DAPI. عرض وتصوير على المجهر مضان.
3. النضج في المختبر (IVM) والإخصاب في المختبر (IVF)
ملاحظة: تم اتباع إجراء IVM من التلقيح الاصطناعي كما هو موضح سابقا مع تعديل طفيف 11،12،13.
- إعداد متوسطة نضوج جديدة (+DHP المتوسطة) قبل تشريح المبيض من أنثى حمار وحشي الكبار. لإعداد وسيط النضج الطازج، أضف 9 مل من متوسط L-15 من Leibovitz، درجة الحموضة 9.0، إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل. أضف 10 ميكرولتر من 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 ملغم/مل)، و490 ميكرولتر من dH2O، و500 ميكرولتر من ألبوم مصل البقر 10٪ (BSA).
- إعداد حل هانك والحل E3 مقدما. إعداد حل هانكس كما وصفها Baarsوآخرون. إعداد E3 المتوسطة: 5 MM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, و 1-5٪ الميثيلين الأزرق.
- إجراء تشريح المبيض حمار وحشي وعزل بصيلات المبيض كما هو الحال في الخطوة 2.
- جمع بصيلات مرحلة كاملة نمت واستخدام البويضات غير ناضجة. لكل أنثى حمار وحشي بالغة ، يمكن عزل ما لا يقل عن 150-200 بصيلات المرحلة الكاملة. حدد بصيلات سليمة وصحية لIVM.
- احتضان بصيلات المرحلة كاملة النمو في +DHP المتوسطة في لوحات 12 بئرا، والتحقق بشكل دوري لضمان أن البويضات لا تزال سليمة. إزالة أي البويضات lysing مع ماصة باستور.
ملاحظة: خلال نضوج البويضات ، ستصبح البويضات شفافة تدريجيا. غالبية البويضات تصبح شفافة بعد علاج DHP لمدة 2 ساعة. ويمكن ملاحظة ذلك تحت المجهر تشريح مع البصريات الضوئية المنقولة. - قم بإزالة الخلايا الجريبية الخارجية من كل بويضة ناضجة كما هو موضح في الخطوة 2.3.
- نقل البويضات دنود إلى طبق بيتري مع بضع قطرات من الثقافة المتوسطة والمضي قدما في الإخصاب.
- إعداد محلول الحيوانات المنوية الطازجة باستخدام الخصيتين تشريحها من ثلاثة ذكور على الأقل في 500 ميكرولتر من محلول هانكس. ضع محلول الحيوانات المنوية على الجليد ، حيث يمكنه الحفاظ على فعاليته من الإخصاب لمدة تصل إلى 2-3 ساعة.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الحيوانات المنوية إلى البويضات الناضحة والمنضجة على طبق بيتري. إضافة بلطف محلول الحيوانات المنوية بين البيض، ودوامة الحيوانات المنوية والبيض معا باستخدام طرف ماصة.
- أضف على الفور 1 مل من محلول E3 المتوسط لتنشيط البيض ومرة أخرى دوامة بلطف البيض والحيوانات المنوية باستخدام طرف ماصة.
- بعد حوالي دقيقة واحدة بعد الإخصاب (mpf) ، أغرق اللوحة بمحلول متوسط E3. ويمكن ملاحظة توسع chorion الكامل في غضون 10-15 mpf.
- بين 35-45 mpf ، حدد الأجنة التي تمر بانشقاق متناظر في مرحلة الخلية 2 ، والتي يتم تخصيبها بالتالي. إزالة الأجنة التي لا تخضع لانشقاق الخلايا.
- السماح للأجنة بالتطور في طبق بيتري عند 28 درجة مئوية، بحد أقصى 80 جنينا لكل طبق طوله 10 سم. عرض وتصوير تطور الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام هذه الطريقة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في مراحل مختلفة من تطور بصيلات المبيض في سمك الحمار الوحشي. الشكل 1 يظهر فصل البويضات حمار وحشي والخلايا الجريبية من بصيلات المبيض باستخدام أنبوب زجاجي شعري(الشكل 1). وللتحقيق فيما إذا كانت الخلايا الجريبية قد فصلت عن الجريبات السليمة، كانت الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة عن مراحل مختلفة من الجريبات من مرحلة الكهروضوئية إلى مرحلة FG ملطخة ب DAPI (50 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يمكن أن تكون نواة الخلايا الجريبية ملطخة من قبل DAPI. لوحظت الإشارة الزرقاء للDAPI في بصيلات سليمة ولكن ليس البويضات المنضحة(الشكل 2). وهذا يشير إلى أن البويضات والخلايا الجريبية للجريب يمكن فصلها بشكل نظيف بهذه الطريقة. ولزيادة تأكيد الانفصال الواضح، تم قطع الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة إلى أقسام النسيج. وأظهرت نتائج تلطيخ DAPI أن الخلايا الجريبية تمت إزالتها بوضوح في البويضات الناضحة(الشكل 3). كل هذه النتائج تشير إلى أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات مرحلة مختلفة من حمار وحشي.
ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة نضوج البويضات من حمار وحشي. لدراسة الاتصال ثنائي الاتجاه بين البويضات والخلايا الجريبية أثناء نضوج البويضات ، يجب الحصول على البويضات النضحة لإجراء فحوصات مختلفة. باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية التي تم سحبها ، تم العثور على البويضات المنفوخة المنفصلة عن بصيلات حمار وحشي المرحلة الكاملة النمو للخضوع لنضوج البويضات العفوي دون أي علاج بعد 4 ساعات من الحضانة ، وعادة ما يكون على الأقل 30٪ من البويضات المنفصلة على قيد الحياة ويمكن أن يصل معدل نضج هذه البويضات الناجية إلى 80٪(الشكل 4). يمكن أن تخضع هذه البويضات الناضجة لتوسيع المشيمة الكاملة بعد وضعها في الماء ، مما يشير إلى أن الخلايا الجريبية تمت إزالتها تماما(الشكل 4). وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على البويضات النضحة لدراسة نضوج البويضات من حمار وحشي.
ويمكن استخدام هذه الطريقة للتلقيح الاصطناعي في حمار وحشي. وقد ثبت جيدا في النضج المختبري (IVM) أساليب في حمار وحشي. باستخدام هذه الأساليب ، يمكن حث بصيلات المرحلة الكاملة النمو إلى المرحلةالناضجة 11،12،13،15،16. لإجراء مزيد من الإخصاب في المختبر (IVF) ، لا تزال الطبقة الجريبية من الجريبات الناضجة بحاجة إلى إزالتها يدويا. هنا ، تم تحريض IVM من سمك الحمار الوحشي عن طريق علاج DHP. تمت إزالة الطبقة الجريبية من الجريبات الناضجة بواسطة أنبوب زجاجي شعري. يمكن تخصيب هذه البويضات المتخلصة من المتابعة وتطويرها إلى مرحلة الفقس(الشكل 5). وتشير النتيجة إلى أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للتلقيح الاصطناعي في حمار وحشي. عادة ما يمكن الحصول على حوالي 10٪ من الأجنة السليمة من البويضات الناضجة.
الشكل 1. فصل الخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المبيض حمار وحشي باستخدام الشعرية الزجاجية سحبت. 1) مورفولوجيا المسام سليمة في مرحلة FG. 2) استنشاق المسام سليمة في الشعرية الزجاجية سحبت. 3) يتم فصل الخلية الجريبية من البويضات عندما يتم تفجير المسام من الشعيرات الدموية الزجاجية التي تم سحبها. 4) فصل ناجح للخلايا الجريبية والبويضات. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مورفولوجيا بصيلات سليمة والبويضات المنشعبة فصلت عن مراحل مختلفة من بصيلات بعد تلطيخ DAPI. تم تلوين الجريبات السليمة والبويضات المنفصلة عن مراحل مختلفة من الجريبات من مرحلة PV إلى مرحلة FG من قبل DAPI. لوحظت الإشارات الزرقاء ل DAPI في بصيلات سليمة ولكن لم تنضح البويضات. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. أقسام النسيجية من بصيلات سليمة والبويضات المعزولة بعد تلطيخ DAPI. تم تصور نواة الخلية من الخلايا الجريبية مع تلطيخ DAPI. يمكن ملاحظة الإشارة الزرقاء. تمت إزالة الخلايا الجريبية بوضوح في البويضات الناضحة. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. النضج والتوسع المشيمي الكامل للبويضات الناضحة المنفصلة عن بصيلات المرحلة الكاملة المزروعة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المنسحبة. (أ)مورفولوجيا بصيلات سليمة في بصيلات مرحلة كاملة النمو. (ب)يمكن أن تخضع البويضات النضحة المنفصلة عن بصيلات المرحلة الكاملة الناضجة لنضوج البويضات التلقائي دون أي علاج بعد 4 ساعات من الحضانة. (ج)يمكن أن تخضع البويضات الناضجة لتوسيع الكورون الكامل بعد التنشيط عن طريق الماء. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. مورفولوجيا الأجنة المبكرة التي تم الحصول عليها من قبل IVM والتلقيح الاصطناعي. تم تحريض IVM عن طريق علاج DHP (5 ميكروغرام / مل) لمدة 2 ساعة. بعد IVM ، تمت إزالة الخلايا الجريبية من البويضات الناضجة بواسطة شعرية زجاجية سحبت. تم تخصيب البويضات الناضجة عن طريق التلقيح الاصطناعي. تم مشاهدة وتصوير تطور الأجنة في مراحل مختلفة. أشرطة المقياس: (A-I) 200 ميكرومتر ، (J) 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف هنا طريقة جديدة للفصل البسيط والسريع للخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المبيض حمار وحشي. هذا الأسلوب له العديد من المزايا على الطريقة التقليدية. ومن بين هذه العوامل الرئيسية زيادة سهولة الفصل بدرجة كبيرة مع كفاءة وفعالية عالية، حيث لا يلزم سوى معالجة واحدة وخارجية. هذه النقطة تزيد من إمكانية التطبيق على الباحثين الذين ليسوا جيدين في التشريح المجهري. وفقا لخبرتنا، يمكن للمرء أن يفصل بنجاح الخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المرحلة نمت بالكامل في غضون 5-10 ق باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 30-60 ق للقيام بهذا الفصل باستخدام ملقط. والأهم من ذلك، عادة ما لا يقل عن 20٪ من البويضات النضحة مفصولة بالشعيرات الدموية الزجاجية يمكن أن تخضع لنضوج البويضات التلقائي. في المقابل ، لا يمكن أن يخضع ما يتجاوز 1٪ من البويضات النضحة لنضوج البويضات التلقائي باستخدام ملقط. وبالتالي ، فإن كفاءة وفعالية الطريقة الجديدة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية هي أفضل من الطريقة المعمول بها سابقا باستخدام ملقط. ثانيا، يمكن استخدام هذه الطريقة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المبيض في مراحل النمو المبكرة مثل المراحل الكهروضوئية، EV، وMV. ولا يمكن إجراء هذا الفصل في مرحلة مبكرة من الجريبات باستخدام المنهجيات الحالية.
وهناك أيضا عدد قليل من القيود باستخدام هذا الأسلوب. على سبيل المثال، القطر المناسب لفتحة الشعيرات الدموية الزجاجية أمر بالغ الأهمية لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في هذه الطريقة. فتح أكبر بكثير أو أصغر من حجم بصيلات المبيض من شأنه أن يؤدي إلى فشل الانفصال. وبالتالي ، يجب تعديل القطر الافتتاحي للشعيرات الدموية الزجاجية اعتمادا على حجم بصيلات المبيض ، والتي تحتاج إلى بعض الممارسة.
فصل الخلايا الجريبية والبويضات لها عدة تطبيقات في دراسة تطور المبيض. يمكن استخدام الخلايا الجريبية والبويضات في مراحل مختلفة من بصيلات المبيض التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لتحليل التعبير الجيني. يمكن استخدام الخلايا الجريبية المنفصلة زراعة الخلايا الأساسية. البويضات الdenuded فصل مفيدة للتحقيق في الحديث المتبادل بين الخلايا الجريبية والبويضات، وتوفير نموذج جيد لدراسة نضوج البويضات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لإزالة الخلايا الجريبية في بعض المقايسات مثل نضوج البويضات في المختبر أو الإخصاب في المختبر. وينبغي أن يسهل توافر طريقة تزيد إلى حد كبير من سهولة وسرعة الانفصال الاستغلال الأوسع لبصيلات المبيض من سمك الحمار الوحشي في الهدف الطويل الأجل المتمثل في فهم تعقيدات تطور المبيض. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بنية بصيلات المبيض متشابهة بين أنواع الأسماك المختلفة؛ وبالتالي، فإنه من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في الأسماك الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [32060170 و 31601205 و 31560334] ، وهو مشروع باحث زائر يدعمه مجلس المنح الدراسية الصيني وصندوق مختبر الدولة الرئيسي لإيكولوجيا المياه العذبة والتكنولوجيا الحيوية [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
