Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Abstract

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM), doku mikroatominin eşi görülmemiş üç boyutlu görünümünü sunan yüzlerce ila binlerce seri kayıtlı ultrayapısal görüntünün toplanmasına izin verir. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar. Bununla birlikte, uygun doku hazırlığı olmadan hücresel ultrayapı, yanlış veya yanıltıcı sonuçlar çıkarılacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, görüntüler reçine gömülü biyolojik örneğin blok yüzünün taranarak oluşturulur ve bu genellikle ele alınması gereken zorluklar ve hususlar sunar. "Doku şarjı" olarak bilinen görüntüleme sırasında blok içinde elektronların birikmesi, kontrast kaybına ve hücresel yapıyı takdir edememesine neden olabilir. Ayrıca, elektron ışını yoğunluğunu / voltajını artırmak veya ışın tarama hızını azaltmak görüntü çözünürlüğünü artırabilirken, bu aynı zamanda reçine bloğuna zarar vermenin ve görüntüleme serisindeki sonraki görüntüleri bozmanın talihsiz yan etkisine sahip olabilir. Burada hücresel ultrayapıyı koruyan ve doku şarjını azaltan biyolojik doku örneklerinin hazırlanması için rutin bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, doku bloğunda en az hasarla yüksek kaliteli seri görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için görüntüleme hususları sağlıyoruz.

Introduction

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) ilk olarak 1981 yılında Leighton tarafından reçineye gömülü dokunun ince bölümlerini kesebilen ve görüntüleyebilen dahili bir mikrotom ile artırılmış bir tarama elektron mikroskobu yaptığı açıklandı. Ne yazık ki, teknik sınırlamalar, biyolojik doku gibi iletken olmayan numuneler kabul edilemez şarj seviyeleri biriktirdiği için iletken numunelerle kullanımını kısıtladı (doku örneğinde elektron birikmesi)1. Buharlaştırılmış karbon azaltılmış doku şarjı ile kesimler arasındaki blok yüzünü kaplarken, bu büyük ölçüde artan görüntüleme alma süresi ve görüntü depolama, o zamanlar bilgisayar teknolojisi cihaz tarafından oluşturulan büyük dosya boyutlarını yönetmek için yetersiz olduğu için bir sorun olmaya devam etti. Bu metodoloji Denk ve Horstmann tarafından 2004 yılında değişken basınç odası2ile donatılmış bir SBF-SEM kullanılarak yeniden ele alındı. Bu, numune içindeki şarjı azaltan görüntüleme odasına su buharının girmesine izin verdi ve iletken olmayan örneklerin görüntülenmesini görüntü çözünürlüğü kaybına rağmen uygulanabilir hale getirdi. Doku hazırlama ve görüntüleme yöntemlerinde daha fazla iyileştirme artık yüksek vakum kullanılarak görüntülemeye izin verir ve SBF-SEM görüntüleme artık şarj 3 , 4,5,6,7,8,9'udağıtmak için su buharı güvenmez. SBF-SEM'de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir.

SBF-SEM, 3-5 nm10,11gibi küçük düzlemsel çözünürlüğe sahip binlerce seri kayıtlı elektron mikroskopi görüntülerinin otomatik olarak toplanmasına izin verir. Ağır metallerle emprenye edilen ve reçineye gömülü doku, elmas bıçakla donatılmış bir ultramikrotom içeren bir tarama elektron mikroskobuna (SEM) yerleştirilir. Elmas bıçakla düz bir yüzey kesilir, bıçak geri çekilir ve bloğun yüzeyi, doku ultrayapısının bir görüntüsünü oluşturmak için elektron ışını ile raster desende taranır. Blok daha sonra z ekseninde "z-adım" olarak bilinen belirli bir miktar (örneğin, 100 nm) yükseltilir ve işlem tekrarlanmadan önce yeni bir yüzey kesilir. Bu şekilde doku kesildikçe 3 boyutlu (3D) bir görüntü bloğu üretilir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından daha fazla yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar.

SBF-SEM görüntüleme öncelikle blok yüzün görüntüsünü oluşturmak için geri saçılmış elektronlar kullanırken, görüntüleme işlemi sırasında ikincil elektronlar üretilir12. İkincil elektronlar, bloktan kaçmayan geri saçılmış ve birincil ışınlı elektronların yanı sıra birikebilir ve blok yüzünde lokalize bir elektrostatik alana yol açabilecek "doku şarjı" üretebilir. Bu elektron birikimi görüntüyü bozabilir veya elektronların bloktan atılmasına neden olabilir ve geri teli dedektörü tarafından toplanan sinyale katkıda bulunarak sinyal-gürültü oranını13azaltır. Doku şarj seviyesi elektron ışını voltajı veya yoğunluğu azaltılarak veya ışın durma süresini azaltarak azaltılabilirken, bu sinyal-gürültü oranının azalmasına neden olur14. Daha düşük voltajlı veya yoğunlukta bir elektron ışını kullanıldığında veya kirişin her piksel alanında daha kısa bir süre kalmasına izin verildiğinde, dokudan daha az geri saçılmış elektron atilir ve elektron dedektörü tarafından yakalanır ve daha zayıf bir sinyalle sonuçlanır. Denk ve Horstmann, bu sorunu odaya su buharı sokarak ele aldı, böylece görüntü çözünürlüğü pahasına odadaki ve blok yüzündeki yükü azalttı. 10-100 Pa oda basıncı ile, elektron ışınının bir kısmı görüntü gürültüsüne ve çözünürlük kaybına katkıda bulunan dağınıktır, ancak bu aynı zamanda numune bloğu2içindeki yükü nötralize eden numune odasında iyonlar üretir. Numune bloğu içindeki yükü nötralize etmek için daha yeni yöntemler, görüntüleme sırasında blok yüzü üzerinde azot odak gazı enjeksiyonu veya prob-ışınlı kepçe enerjisini azaltmak ve toplanan sinyali artırmak için SBF-SEM aşamasına negatif voltaj getirmek içinkullanır 6,7,15. Blok yüzeyinde yük birikmesini azaltmak için sahne önyargısı, oda basıncı veya lokalize azot enjeksiyonu getirmek yerine, daha agresif görüntüleme ayarlarına izin vererek reçine karışımına karbon sokarak reçinenin iletkenliğini artırmak da mümkündür16. Aşağıdaki genel protokol, 2010 yılında yayınlanan Deerinck ve ark. protokolünün bir uyarlamasıdır ve yüksek çözünürlüklü görüntü alımını korurken doku şarjını en aza indirmek için yararlı bulduğumuz doku hazırlama ve görüntüleme metodolojilerinde yapılan değişiklikleri kapsar3,17,18,19. Daha önce bahsedilen protokol doku işleme ve ağır metal emprenyesine odaklanırken, bu protokol SBF-SEM çalışmalarının doğasında bulunan görüntüleme, veri analizi ve rekonstrüksiyon iş akışı hakkında fikir vermektedir. Laboratuvarımızda bu protokol kornea ve ön segment yapıları da dahil olmak üzere çok çeşitli dokulara başarıyla ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanmıştır, göz kapağı, lakrimal ve sert bezi, retina ve optik sinir, kalp, akciğer ve hava yolu, böbrek, karaciğer, cremaster kası ve serebral korteks / medulla ve fare, sıçan, tavşan, kobay, balık, monolayer ve tabakalı hücre kültürleri, domuz, insan olmayan primat ve insan20 , 21,22,23dahil olmak üzere çeşitli türlerde. Küçük değişiklikler belirli dokular ve uygulamalar için değerli olsa da, bu genel protokol temel görüntüleme tesisimiz bağlamında son derece tekrarlanabilir ve yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvanlar, Görme ve Oftalmik Araştırmalarda Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Houston Üniversitesi Optometri Üniversitesi hayvan işleme yönergelerinde açıklanan yönergelere göre ele alındı. Tüm hayvan prosedürleri ele alındıkları kurumlar tarafından onaylandı: Fare, sıçan, tavşan, kobay ve insan dışı primat prosedürleri Houston Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, zebra balığı prosedürleri DePauw Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve domuz prosedürleri Baylor College of Medicine Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm insan dokusu, insan dokusu ile ilgili araştırmalara ilişkin Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak ele alınmış ve uygun kurumsal inceleme kurulu onayı alınmıştır.

1. Doku İşleme

  1. Sodyum kakodylat tozunu ddH 2 O'da karıştırarak0,4M sodyum kakadodylat tampon stok çözeltisi hazırlayın. Bu tampon, fiksatif (aşağıda adım 1.3'te açıklanan kompozisyon), yıkama tamponunun yanı sıra osmiyum ve potasyum ferrosiyanür çözeltileri yapmak için kullanılır.
    NOT: Perfüzyon fiksasyonu genellikle SBF-SEM çalışmaları için en iyi fiksasyon yöntemidir, çünkü fiksasyon hızla ve tüm vücutta gerçekleşir. Çalışma tasarımınızda perfüzyon fiksasyonu mümkün değilse, 1.3.
  2. Hayvan modeli24, 25,26için uygun fizyolojik basınçla perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin. Bu, heparinize salin ile transkardiyal sıralı perfüzyon ve ardından her biri organizmanın üzerinde belirli bir yüksekliğe (örneğin, hayvan modelinde vasküler sistemin fizyolojik basıncına uygun) yerleştirilen, sol ventrikül içine fiksatif akan ve sağ kulakçıkta yapılan bir kesiden çıkan fiksatif ile yapılır. Kan fiksatif ile değiştirildiği için ilgi çekici doku soluklaşır, eğer dokunuzun tamamı veya bir kısmı döknmezse, doku uygun şekilde sabitlenmeyebilir ve ultrayapı korunmayabilir.
  3. Doku örneklerini 2 mm x 2 mm x 2 mm'den büyük olmayan bloklar halinde kırpmak için jilet veya keskin neşter kullanın. 1.2. adım atlandıysa, bunu hızlı bir şekilde yapın, böylece doku mümkün olduğunca çabuk sabitlenebilir.
    1. Alternatif olarak, dokuyu fiksatif altında parçalara parçalar ve daldırma işlemini tamamlamak için taze fiksatife aktarın. Fiksatifin son bileşimi% 2.5 glutaraldehit ve 2 mM kalsiyum klorür içeren 0.1 M sodyum kakadül tampondan oluşur. Fiksasyonun oda sıcaklığında en az 2 saat ve 4 °C'de en fazla bir gecede devam etmesine izin verin. Mümkünse, sabitleme yaparken numuneleri hafifçe çalkalamak için bir rocker/tilt plakası kullanın.
    2. Alternatif olarak, bir invertör mikrodalga varsa, 1 dakika açık, 1 dakikalık kapalı 4 döngü için 150 watt'ta vakum altında yukarıda belirtilen fiksatifte dokuyu sabitlayın. Mikrodalga fiksasyonu, dokuyu hızla sabitlemiş ve doku ultrayapısını koruduğuiçin 1.3.
      NOT: Bu protokol sırasında dokunun kurumasına asla izin verilmemeli, dokuyu bir çözeltiden diğerine hızlı bir şekilde aktarmaya özen verilmelidir.
  4. Sabit dokuyu 2 mM kalsiyum klorür içeren 0,1 M sodyum kakadot tamponunda oda sıcaklığında her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  5. Aşağıdaki osmiyum ferrosiyanür çözeltisini, tercihen önceki yıkama adımları sırasında taze hale getirin. %4 osmiyum tetroksit çözeltisi (ddH 2 O'da hazırlanmıştır)0,2M kakadodylat tamponda% 3 potasyum ferrosiyanid eşit hacimde 4 mM kalsiyum klorür ile birleştirin. Önceki yıkama adımından sonra, dokuyu bu çözeltiye karanlıkta buzda ve duman kaputunda 1 saat yerleştirin.
    NOT: Osmiyum tetroksit, ampulde gelen sarı kristal bir maddedir. Osmiyum tetroksit çözeltisini oluşturmak için ampulü açın, ddH2O ekleyin ve kristaller tamamen çözünene kadar karanlıkta 3-4 saat sonicate edin. Osmiyum tetroksit çözeltisi açık sarı bir çözeltidir, çözelti siyahsa osmiyum azaltılmıştır ve artık kullanılmamalıdır.
  6. Doku osmiyum ferrosiyanit çözeltisinde inkübasyon yaparken, tiyokarbohidrazid (TCH) çözeltisini hazırlamaya başlayın. Bu çözeltiyi taze hazırlayın ve 1 saatlik osmiyum ferrosiyanür fiksasyon süresinin sonunda kolayca kullanılabilir hale verin. 0,1 g tiyokarbohidrazid ile 10 mL ddH2O'yu birleştirin ve bu çözeltiyi 1 saat boyunca 60 °C fırına yerleştirin. Çözeltinin çözüldüğüne emin olmak için her 10 dakikada bir hafifçe döndürün. Kullanmadan önce, bu çözeltiyi 0,22 μm şırındi filtresinden filtreleyin.
  7. TCH'de inkübasyon yapmadan önce, dokuyu oda sıcaklığında ddH2O 5x ile her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) yıkayın.
  8. Dokuyu filtrelenmiş TCH çözeltisine oda sıcaklığında toplam 20 dakika yerleştirin (Şekil 1A-C).
  9. TCH'de inkübasyonu takiben, dokuyu oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  10. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %2 osmiyum tetroksit (potasyum ferrosiyanür ile azaltılmış osmiyum değil) içeren ddH2O'ya doku yerleştirin. Bu duman kaputunda ve karanlıkta yapılmalıdır, çünkü osmiyum ışıkla azaltılabilir (örneğin, alüminyum folyo altında) (Şekil 1D-F).
  11. Osmiyum tetroksit inkübasyonunu takiben, oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x dokunun.
  12. Dokuyu 4 °C'de bir buzdolabında gece boyunca%1sulu uranil asetat (ddH 2 O'ya karıştırılan uranil asetat tozu) içine yerleştirin.
  13. Buzdolabından doku çıkarmadan hemen önce, taze Walton'un kurşun aspartat çözeltisini hazırlayın. 0.03 M aspartik asit çözeltisinin 10 mL'sinde 0.066 g kurşun nitrat eriterek başlayın (damıtılmış suyun 10 mL'sinde 0.04 g aspartik asit) ve pH'ı 1 N KOH (10 mL damıtılmış suda 0.5611 g) ile 5.5'e ayarlayın.
    DİkKAT: pH'ı ayarlarken bir çökelti oluşabilir. Bu kabul edilebilir bir şey değil.
    1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, pH'ı izlerken yavaşça 1 N KOH damla yönünde ekleyin. Bitmiş şeffaf kurşun aspartat çözeltisini 60 °C fırında 30 dakika önceden ısıtın. Bir çökeltme oluşursa çözelti kullanılamaz ve başka bir çözüm hazırlanmalıdır.
  14. Dokuyu buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında ddH2O'da her biri 3 dakika (toplam 15 dakika) 5x yıkayın.
  15. Yıkadıktan sonra, sıcaklığı 60 ° C'de tutarken, dokuyu ısıtılmış Walton'un kurşun aspartat çözeltisine 30 dakika yerleştirin.
  16. Walton'un kurşun aspartatında inkübasyondan sonra, dokuyu oda sıcaklığında ddH 2 O (Şekil 1G-I)içinde her biri3dakika (toplam 15 dakika)5x yıkayın.
  17. Buz gibi bir aseton serisi (%30, %50, %70, %95, %95, %100, %100 ve %100 aseton (varsa ddH2O'da) ile dokuyu susuz bırakın ve serinin her adımı için 10 dakika bekleyin.
  18. Buz gibi dehidrasyon serisini takiben, dokuyu 10 dakika boyunca oda sıcaklığı asetonunda yerleştirin.
    1. Bu süre zarfında, Embed 812 ACM reçineyi formüle edin. Işın hasarına karşı daha dayanıklı olduğu için "sert karışım" tarifini kullanın. Reçineyi iyice karıştırın ve dokuyu 4 saat boyunca 812:aseton (1:3 karışım) katıştırın, ardından 8 saat veya gece boyunca 812:aseton (1:1 karışımı) ekleyin ve son olarak gece boyunca 812:aseton (3:1 karışımı) gömün. Bu reçine sızma adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin.
  19. Ertesi gün, dokuyu 4-8 saat boyunca% 100 Gömün 812, daha sonra taze% 100 Bir gecede 812 gömün ve son olarak 4 saat boyunca taze% 100 Gömün 812. Bu reçine sızma adımlarını oda sıcaklığında gerçekleştirin.
    1. Gömmeden hemen önce, az miktarda reçineyi bir karıştırma kabına yerleştirin ve reçine tozla doyurulana ancak hala akışkan olana ve grenli hale gelene kadar karbon siyahı tozunda yavaşça karıştırın (karıştırmak için ahşap bir çubuk kullanılabilir). Kalın mürekkebe benzemeli ve görünür kümeler olmadan ahşap çubuktan yavaşça damlatabilmelidir.
  20. Doku örneklerini silikon kauçuk kalıba yönlendirin ve reçine bloğu içindeki numune yönünün kaydedilmesi ve referans alınabilmesi için bir resim çekin. Numuneleri silikon kalıbın ucunda karbon siyahı doymuş reçine ile örtün ve kalıbı 65 °C'de ~1 saat fırına yerleştirin.
    1. Kalıbı, doku örneğini kapladığı kalıbın ucuna reçineyi içerecek bir eğime yerleştirin. Reçinenin karşı ucundaki kalıba deney/doku örneği tanımlayıcısı içeren bir etiket yerleştirin (Şekil 2A).
  21. Silikon kalıbı fırından çıkarın ve kalıbın geri kalanını etiketin görünür kalmasını sağlamak için net reçine (karbon siyahı yok) ile doldurun. Karbon siyahı ile aşılanmış reçineyi, berrak reçine ile kolayca karıştırmayacak kadar tedavi edin.
    1. Kalıp içinde doku içermeyen ekstra bir kuyu hazırlayın. Ekstra kuyudan başlayarak, kalıbın geri kalanını berrak reçine ile doldurun.
    2. Karbon siyahı aşılanmış reçine berrak reçineye kanamaya başlarsa, silikon kalıbı ek süre (örneğin, 15 dakika) fırına geri yerleştirin.
    3. Tüm doku örnekleri berrak reçine ile doldurulduktan sonra, kürleme işlemini tamamlamak için silikon kalıbı 48 saat boyunca 65 °C'de fırına (düz, eğimsiz) geri yerleştirin.

2. Blok Hazırlama

NOT: Yöntem, örneğin blokta nasıl yönlendirildiğine ve bölümlemenin nasıl gerçekleşeceğine bağlı olacaktır. Bununla birlikte, en yaygın doku yönelimi, reçine bloğunun ucuna ortalanmış, reçine bloğunun uzun ucuna dik olan dokuyu bulur.

  1. Çoğu durumda, önce numune bloğunu mikrotome aynasına yerleştirerek, konik ucu mandrenden yaklaşık 5-6 mm yukarı yapışarak dokuyu bulmak için bloğun ucunun kırpılması. Ayarlanan vida ile yerine kilitleyin ve bir ısı lambasının altına yerleştirin.
  2. Birkaç dakika sonra blok dövülebilir ve kırpılması kolay olacaktır. Mandreni stereomikroskop tutucusuna yerleştirin ve doku görünene kadar blok yüze paralel ince bölümler yapmak için yeni bir çift kenarlı jilet kullanın. Bu en iyi blok yüzünde angling ışığı ile görülür, doku örneği, reçinenin dokudan yoksun kısımlarına kıyasla daha az yansıtıcı ve ayrıntılı olacaktır. Dokunun nasıl ve nerede bulunduğu hakkında bir fikir için karbon siyahı doymuş reçinenin tanıtımından önce doku örneklerinin fotoğrafına danışın.
  3. Kırpma amacıyla bir numune pim tutucusu bir kenara koyun. Bu pim tutucu asla SEM haznesine yerleştirilecektir ve bu nedenle eldivensiz olarak ele alınabilir, bu kesme pimi tutucusu olarak adlandırılır. Görüntüleme odasına yerleştirilecek herhangi bir numune tutucuya eldivensiz asla dokunulmamalıdır. Bu, mikroskop odasına gres ve yağ girmesini önler.
  4. Kırpma pim tutucusuna alüminyum bir numune pimi yerleştirin ve pim tutucunun 3-4 mm üzerinde tutulan pimin yüzü (düz yüzey) ile set vidasını hafifçe sıkın.
  5. Numuneyi yerinde tutmak için kullanılan tutkal için daha geniş bir yüzey alanı sağlamak için pimin yüzünde birkaç derin, çaprazlama çizikleri yapın. Alüminyum pim kullanılırsa, bu adım için küçük bir çelik düz başlı tornavida önerilir (Şekil 2B).
  6. Doku örneğini içeren mandreni, reçine yumuşak ve dövülebilir hale gelene kadar ısı lambasının altına geri yerleştirin, ardından stereomikroskopun altındaki ayna kabına yerleştirin.
  7. Reçine bloğunun doku örneğini içeren kısmından fazla reçineyi kesmek için çift kenarlı bir jilet kullanmak. Sonuçta pime bağlı doku bloğunun boyutu yaklaşık 3 mm çapında ve 2-3 mm yüksekliğinde olacaktır.
    1. Jileti doğrudan reçine bloğuna kabaca 1-2 mm itin, ardından jileti bir önceki kesime eşit derinlikte reçine bloğuna yatay olarak dikkatlice itin. Bloğun doku örneğini içeren kısmına zarar vermek veya kesmek mümkün olduğundan, bunu yavaşça ve büyük bir dikkatle yapın. İki kesik bir araya geldikçe, fazla reçine bloktan ayrılır. Sadece 3 mm x 3 mm yükseltilmiş alan kalana kadar reçineyi çıkarmaya devam edin.
  8. Bu ilk kırpmadan sonra, bloğu (hala aynada) birkaç dakika boyunca ısı lambasının altına yerleştirin.
  9. Reçine yumuşak ve dövülebilir hale geldikten sonra, bloğu stereomikroskopun altına geri yerleştirin. Yeni bir çift kenarlı jilet kullanarak, reçine bloğunun üst kısmını, kesilmiş kısmın yaklaşık 1 mm altında, tek bir pürüzsüz kesimle kesin. Numune pimine yapıştırılacağı için düz bir yüzey tercih edilir. Bu adım bloğun kaldırılan kısmına aktarabilecek ve uçup kaçmasına neden olabilecek bir miktar kuvvet gerektirdiğinden, örneğin kaybolmasına izin vermemeye dikkat edin. Kesilmiş ve kesilmiş numuneyi bir kenara yerleştirin.
  10. Kesilmiş alüminyum pim içeren kırpma pim tutucusuna stereomikroskop haznesine yerleştirin. Pim yüzüne, görünür bir menisküs oluşturmadan pimi tamamen kapacak şekilde ince bir siyanoakrilat tutkal tabakası uygulayın. Doku bloğunun kesilmiş parçasını tokalarla alın ve pim yüzüne yerleştirin. Doku örneğini numune piminin üzerine ortala. Aşağı itin ve birkaç saniye tutun. Tutkalın birkaç dakika ayarlamasına izin verin.
  11. Tutkal iyice kuruduğunda, kırpma pim tutucusuna stereomikroskopun altına geri yerleştirin. İnce bir dosya kullanarak, fazla reçineyi, iğnenin üzerinde hiçbir reçinenin sarkmasın diye dosyala. Reçine şekli dairesel pim kafasına benzemelidir.
  12. Reçine bloğunuzun yükseltilmiş kısmındaki dokuyu bulun, eğik aydınlatma bunun için yararlıdır. Çift kenarlı bir jilet kullanılarak, doku örneğini içeren reçinenin yükseltilmiş kısmı 1 mm2'denbüyük olmayan bir alana kesilmelidir. Mümkünse, blok yüz daha da küçük kesilebilir, bu elmas bıçak üzerindeki stresi azaltacak ve uzun ömürlülüğünü artıracaktır.
    1. Mümkün olduğunca fazla reçineyi çıkarın ve bloğu bir boyutta biraz daha uzun bırakın. Çok fazla kuvvet uygulandığında doku örneğini içeren reçinenin parçalanması mümkün olduğundan, bu yavaşça ve özenle yapılır. Bir jilet önerilirken, bu adım için ince bir metal dosya kullanılabilir.
  13. İnce bir metal dosya açısı ile fazla reçine, doku örneğini içeren yükseltilmiş kısmın dışındaki alanda, pimin kenarına doğru aşağı doğru (Şekil 2C).
  14. Gümüş boya ve ardından altın püskürtme uygulamadan önce hazırlanan numuneden reçine parçacıklarını ve tozları çıkarın. Gümüşü asetonla karıştırın, böylece kolayca yayılabilir bir sıvıdır, ojeye benzer (ancak aplikatörden damlayacak kadar ince değildir) ve tüm numune bloğu yüzeyine ince bir kat uygulayın. Aseton hızla buharlaşır, bu nedenle gümüş boya kalınlaşmaya başladığında ek aseton eklemek gerekebilir.
    1. Mikroskopa yüklenmeden önce gümüş boyanın gece boyunca kurumasını bekleyin.
      NOT: Blok yüzünün 1 mm x 1 mm'nin ötesine genişlememesi için bu gümüş tabakanın ince olması gerekir ve gümüş boya elmas bıçağına hiç zarar vermemiş olsa da, elmas bıçağın uzun ömürlülüğünü korumak için daha küçük blok yüzler önerilir. Gümüşle karıştırılan aseton, görüntüleme odasına aseton buharı sokmaktan kaçınmak için numuneyi mikroskopta altın püskürtmeden veya yüklemeden önce tamamen buharlaşmalıdır.
    2. Gümüş boyanın uygulanmasından sonra, numune bloğuna ince bir altın tabakası uygulayın. Standart bir altın folyo hedefi ile donatılmış standart bir vakum püskürtme cihazı kullanarak, 200 miliTorr (Argon gazı) oda basıncı ve 2 dakika boyunca çalışan 40 miliamper, 20 nm kalınlığında altın kaplama ile sonuçlanacaktır.
  15. Kaplamadan sonra, monte edilmiş ve kesilmiş bloğu uygun deney etiketi takılı bir tüpe yerleştirin. Tek kullanımlık transfer pipetleri kullanarak özel tüpler oluşturun.
    1. Transfer pipetini ampulnün hemen altına kesin, transfer pipet tüpünün kısa bir kısmını soğanlı ucun altına takın. Kesilen boru kısmını kısaltın ve pipet ucunu yeterince geri kesin, böylece alüminyum numune pimi içine sokulabilir.
    2. Alüminyum numune pimini içeren ucu modifiye transfer pipetinin soğanlı ucuna yerleştirin.
  16. Hazırlanan bir doku bloğunu yüklemeden önce, fazla gümüş boyayı blok yüzünün yüzeyinden dikkatlice kesin.

3. Blok Yüzü Görüntülemek için SEM Ayarları

NOT: Takip eden görüntüleme ayarları, yazarlar tarafından kullanılan ve sağlanan Materyaller Tablosunda listelenen cihazda üretilmiştir. Bu cihaz değişken basınçlı görüntüleme yeteneğine sahip olsa da, en iyi sonuçlar yüksek vakum altında yakalandı.

  1. Durma Zamanı: Seri kesitleme sırasında 12 μs/px kullanın. İlgi çekici bir bölge tespit edildiğinde, 32 μs/px'te daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü elde edilebilir.
  2. Vakum Ayarları: 9e-008 Pa'lık bir top basıncı, 1.1e-004 Pa'lık bir kolon basıncı ve 9.5e-002 Pa oda basıncı kullanın.
  3. Yakalama Süresi: Yukarıdaki ayarlarla, görüntü başına 50 saniye hızında 2048x2048 px görüntü yığını yakalayın. İlgi çekici bölgelerin daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri, görüntü başına 9 dakikadan biraz daha az bir hızda 4096x4096 px'te yakalanabilir.
  4. Kesit Kalınlığı: 100-200 nm kullanın. Daha azı mümkündür, ancak daha düşük ışın voltajı, yoğunluğu veya durma süresi gerektirebilir.
  5. Yüksek Gerilim (HV): 7-12 kV kullanın. Gerilimi artırmak spot boyutunu azaltır ve çözünürlüğü artırırken, ışın hasarı için daha fazla olasılık sunar. Daha yüksek kV, ışın penetrasyonunu arttırır ve bu da ayrıntıların kaybolmasına neden olur. Bununla birlikte, kV'nin düşürülmesi sinyali gürültü oranına düşürür (Şekil 3)14.
  6. Işın Yoğunluğu (BI): Yazarın SBF-SEM cihazı 1-20 arasında değişen bir ışın yoğunluğu ölçeği sunar. Bu ölçekte, 5-7 değerleri aşırı şarj ve ışın hasarı olmadan kaliteli görüntüler verir. BI ne kadar yüksek olursa çözünürlük o kadar büyük olursa, şarj etme ve ışın hasarı14.
  7. Spot Boyutu ve Görüntü Büyütme: Işın yoğunluğuna ve voltaj seviyesine göre nokta boyutunu belirleyin. İdeal olarak, spot boyutu kullanılan piksel boyutundan daha büyük olmamalıdır. Piksel boyutu, görüş alanının (FOV) piksel sayısına bölünmesiyle belirlenir. Örneğin, görüntü boyutu 2048x2048 piksel olan 25 μm FOV piksel başına 12,2 nm verir. Bu nedenle spot boyutu 12,2 nm'den büyük olmamalıdır. Şekil 4, HV, BI ve spot boyutunun nasıl ilişkili olduğunu göstermektedir.
  8. Çalışma Mesafesi (WD) - Blok yüz görüntüleme ile çalışma mesafesi ayarlanamaz. Bu sadece bir odaklanma faktörüdür. Görüntülenmiş tüm bloklar için neredeyse aynı olacaktır. Çalışma mesafesi ayarlanamazken, yakalanan görüntünün çözünürlüğünde kritik bir rol oynar. Çalışma mesafesi azaldıkça, yakalanan görüntülerdeki çözünürlük sınırı artar. Bazı durumlarda görüntüleme odasında değişiklikler yaparak çalışma mesafesini azaltmak mümkün olabilir, ancak bu değişiklikler kullanıcının takdirine bağlı olarak yapılmalıdır. Çalışma mesafesini azaltmak ve görüntü çözünürlüğünü artırmak için kapı montaj mikrotom vidalarını gevşettik ve mikrotomları vidaları yeniden iyileştirdikten sonra ışın dedektörüne ~2 mm daha yakın olacak şekilde yeniden konumlandırdık.
  9. Çözünürlük - Yukarıdaki ayarları kullanarak, 3,8 nm'ye kadar x & y çözünürlük mümkündür. Çözünürlüğün ışın nokta boyutunun yanı sıra görüntü yakalamalarının piksel çözünürlüğü ile sınırlı olduğunu belirtmek önemlidir (örneğin, 2048x2048 piksel görüntüde yakalanan 20 μm görüş alanı, 3,8 nm spot boyutu kullanılmış olsa bile 9,8 nm piksel çözünürlüğüne sahiptir). z düzlemdeki görüntü çözünürlüğü kesit kalınlığına bağlıdır, 100-200 nm'nin bu protokolle iyi çalıştığını görüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare Korneası
Bu protokol fare korneasına kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerden (EFMB) oluşan bir ağın mevcut olduğu gösterilmiştir. Daha önce bu ağın sadece embriyonik ve erken postnatal gelişim sırasında mevcut olduğuna inanılıyordu. SBF-SEM, kornea boyunca geniş bir EFMB ağı ortaya çıkardı ve kesit şeklinde ölçüldüğünde 100-200 nm çapında olduğu tespit edilen bireysel lifler bulundu. Ayrıca, bu EFMB ağının keratositlerle yakından ilişkili liflerle, hatta keratosit yüzeyinde sığ invaginasyonlar içinde uzanarak farklı katmanlarda düzenlendiği bulunmuştur (Şekil 5). Yetişkin korneasında EFMB liflerinin keşfi, bu ağın doğasını daha iyi anlamak için immüngold etiketleme iletim elektron mikroskopisi (TEM), floresan ve konfokal çalışmalara yol açmıştır23.

Bu protokolün daha fazla uygulanması, stromal-epitel sınırda bazal epitel hücreleri ile kaynaşan merkezi kornea sinirlerinin daha önce bilinmeyen bir popülasyonunun keşfedilmesine yol açmıştır (Şekil 6). Daha önce, bu sınırdaki epitel ile etkileşime giren tüm sinirlerin kornea epiteline nüfuz ettiğine ve subbasal ve epitel pleksiyi ürettiğine inanılıyordu. Bu çalışmada bazal epitel ile etkileşime giren merkezi sinirlerin ~%45'ine basit penetrasyon yerine hücre-hücre füzyonu uygulandı. SBF-SEM veri setlerine uygulanan stereolojik yöntemler kullanılarak, bu yeni sinir popülasyonunun "şişmiş" görünümleriyle tutarlı olarak, penetrasyonun kabaca yarısı kadar yüzey-hacim oranına sahip olduğunu göstermek mümkündü (Sinir Füzyonu - 3.32±0.25, Sinir Penetrasyonu - 1.39±0.14, p ≤ 0.05). Sinir demetlerinin kaynaşmış kısımlarında mitokondri eksikliğini vurgulayan, nüfuz eden ve kaynaştırıcı sinir demetlerinin ve mitokondrilerinin 3D rekonstrüksiyonları oluşturuldu. SBF-SEM kullanılarak nöronal-epitel hücre füzyonunun keşfi, iki kaynaşmış hücre arasındaki membran sürekliliğini doğrulayan floresan çalışmalarına yol açtı21.

Merkezi kornea bir avasküler dokudur ve bu nedenle periferik limbal vaskülat korneanın genel sağlığı için özel bir öneme sahiptir. Bu bölgenin hücre-hücre ilişkileri ve ultrayapı karmaşıktır; ancak floresan ve tek kesitli TEM çalışmalarında bu hücre-hücre etkileşimlerini ve ultrayapısal bağlantıları takdir etme yeteneği sınırlı olmuştur. Bu nedenle limbal vaskülat, sinir demetleri ve ilişkili hücreler içeren bir SBF-SEM görüntü yığını 3D rekonstrüksiyon için manuel olarak bölümlere ayrılmıştır (Şekil 7). Bu görüntüde vasküler endotel kavşakları ile bindirme perisitleri arasındaki yakın ilişki, perivasküler bir mast hücresinin bireysel granülleri, kan damarı duvarının dış yüzeyi boyunca sürünen bir nötrofilin çekirdeği ve ön kenarı ve geçen bir sinir demeti görülebilir.

Birlikte ele alındığında, bu çalışma gövdesi, bu protokolün hücre dışı matris ve epitel bakımından zengin dokularda, vaskülat ve ilişkili hücrelerde yüksek kaliteli 3D elektron mikroskopi veri setleri üretme yeteneğini göstermektedir.

Yüksek Sıralı Primat Retina - Sinir Pleksus ve Vasküler Ağ
Yüksek sıralı primatların retina sinir lifi tabakası (RNFL) geniş bir damar ağı içerir ve buna bağlıdır. Genellikle, retina hastalıkları, retina sinir lifi tabakasının her iki parametresinde ve içinde bulunan vaskülta değişiklikler içerir. RNFL ile vasküler ağı arasındaki ilişkiyi sağlıklı, patolojik olmayan dokuda anlamak, hastalık sonucu oluşabilecek değişiklikleri anlamanın ilk adımıdır. Bu ilişkinin daha iyi anlaşılması için normal yüksek sıra primat retinaya SBF-SEM protokolü uygulanmış ve damar ağının yeniden inşası yapılmış ve bu rekonstrüksiyondan hacimsel veriler çıkarılmıştır(Şekil 8). RNFL'nin bu 4.642.307μm 3 bölgesi, RNFL'nin toplam hacminin% 2.6'sını oluşturan hacimde 1.207x10-4 μL'lik bir vasküler yatak içeriyordu. Bu çalışma, bu protokolün yoğun nörolojik dokuda yüksek kaliteli 3D elektron mikroskopi veri setleri üretme yeteneğini göstermektedir.

Zebra Balığı ve Dev Danio Kalbi - Çizgili Kas ve Gelişen Vaskülat
Hem zebra balığı hem de dev dans, kalp gelişimi ve yenilenmesi için önemli modellerdir. Tarihsel olarak, zebra balığı kalbi, zebra balığının fizyolojik taleplerini desteklemek için birlikte çalışan anatomik olarak farklı iki miyokard segmenti olarak kabul edilir. Ancak, bu iki ventrikül katmanı arasındaki arayüz iyi anlaşılamadı. Bu protokol kullanılarak, ince bir fibroblast tabakasından oluşan daha önce tanınmayan bir kavşak bölgesi keşfedildi. Bu tabakadaki açıklıkların iki ayrı miyokard segmentin temas etmesine ve desmosomes ve fasya yapışmaları da dahil olmak üzere karmaşık yapışıklık kavşakları oluşturmasına izin verdiği bulunmuştur22.

Bu protokol, gelişmekte olan dev danio kalbinin damar ağını inceleyen daha fazla çalışmada kullanılmıştır (Şekil 9). Bu yöntem, gelişen kardiyak miyosit ağının 3D olarak değer kazanmasına ve gelişen mikrovaskülür ile ilişkisine olanak tanır. Birlikte ele alındığında, bu çalışma bu protokolün kas ve yüksek damarlı dokularda yüksek kaliteli 3D elektron mikroskopi veri setleri üretme yeteneğini göstermektedir.

Görüntü Ayarları, Şarj ve Çözünürlük
Kaliteli SBF-SEM görüntüleme için uygun fiksasyon ve ağır metal boyama gerekli olsa da, aynı derecede önemli olan iletken reçine kullanımı ve ele alınan sorular için uygun görüntüleme ayarlarıdır. Bu protokolde, numune bloğunun iletkenliğini artırmak ve ikincil elektronların blok yüzünden temizlenmesi için montaj pimine bir kanal sağlamak için karbon siyahı kullanımı kullanılır. Bu, karbon siyahı ile hazırlanmayan dokularda görüntü kalitesini sık sık düşüren doku şarjı ile mücadelede etkili olduğu kanıtlanmıştır16. Ek olarak, bloğa uygulanan gümüş boya ve altın sputtering elektron birikimi için bir dağılma yolu sağlar. Bazı cihazlar, blok yüzüne bir puf azot uygulayarak şarjı azaltan bir odak yükü kompansatör eklenmesine izin verir, ancak karbon siyahı kullanımı ve gümüş boya ve altın sputtering uygulaması ile benzer bir başarı elde ettik blok15. Örnek iletkenlik eksikliği, doku şarjı olarak görülebilen elektron birikmesine yol açabilir (Şekil 1), ayrıca görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltan ani görüntü kaydırma ve çarpıtma olarak görülebilen deşarjlara yol açabilir (Şekil 10B & F). Karbon siyahının kullanımı, yüksek vakum altında görüntülemeye ve yüksek sinyal-gürültü oranına ve gelişmiş görüntü çözünürlüğüne neden olan görüntü ayarlarının kullanılmasına izin verir. Görüntü kalitesinin artmasına neden olan bu ayarlardan biri piksel durma süresidir. SBF-SEM görüntüleme işlemi, mikroskop dedektörünün sinyal olarak toplayıp yorumleyebileceği geri saçılmış elektronlar oluşturmak için örnek yüzey boyunca bir elektron ışınının raster taramasını içerir. Bu ışının her pikselin boşluğu içinde bulunmasına izin verilen süre, her piksel konumuna daha doğru bir piksel değeri atanmasına neden olur (Şekil 3A ve B)2. Bununla birlikte, artan sinyal-gürültü, çözünürlük ve blok yüzüne verilen hasar arasında vurulması gereken bir denge vardır. Işın, görüntü bozulması ve kesme komplikasyonlarına neden olan reçineyi parçalayıp yumuşatabilen yüksek enerjili elektronlarla blok yüzünü etkili bir şekilde ışınlar (Şekil 10)28. Z çözünürlüğü ne kadar ince olursa, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi sürdürmek o kadar zorlaşır. Genellikle 100-200 nm z-adımlar kullanıyoruz, ancak 25-50 nm'lik z-adım boyutları5,29,30,31. Bu boyuttaki z-adımlarla, kiriş hasarı nedeniyle reçinenin parçalanması ve yumuşaması, reçinenin sıkıştırılmasına ve bıçağın bir kesimi kaçırmasına veya blok yüzünü kesmesine neden olabilir, ancak bıçağın bloğun yüzeyinden atladığı "gevezelik" ile dalgalanmalar ve bantlaroluşturur 13. Küçük z-adımlar çekici bir olasılık olsa da, uygun bir z-adımı seçerken belirli araştırma sorusunu akılda tutmak önemlidir. Aşırı örnekleme, önemli veri depolama konularına ve 3D rekonstrüksiyonları üretmek için gereken sürede bir artışa yol açabilir.

Doku Fiksasyonu ve Lekelenmesi
Ağır metal inkübasyonundan önce dokular glutaraldehitte sabitlenmelidir. Doku ultrayapısının korunması için vakum altında mikrodalga fiksasyonunu şiddetle tavsiye ederken27, laboratuvar sınıfı mikrodalga mevcut değilse değişken wattlı ticari bir invertör mikrodalga32 , 33,34,35değiştirilebilir. Bu yapılırsa doku bozulmasının oluşmaması için ekstra bakım yapılmalıdır. Yanlış doku fiksasyonu Şekil 10E'degörülebileceği gibi doku morfolojisinde değişikliğe neden olabilir. Bu protokol, çoğu modern SBF-SEM boyama protokolü gibi, 201017'deDeerinck tarafından belirtilen boyama prosedüründen uyarlanmıştır , Willingham ve Rutherford tarafından 198436'daoluşturulan osmium-tiyokarbohidrazid-osmium lekelerine dayanarak . Bu protokolde kullanılan ağır metaller, bir doku örneğindeki hücresel yapılara kontrast ekler (Şekil 1). İlk osmiyum inkübasyonu, membran ve lipit lekelenmesine yol açan doymamış yağlarda C=C bağlarına bağlanan azalmış osmiyum ile ortaya çıkar37,38. Osmiyum, doymuş lipitlerin lekelenmesine yardımcı olan ve fosfolipidleri stabilize etmek için hareket eden potasyum ferrosiyanür ile azalır39,40. Thiocarbohydrazide daha sonra ilk inkübasyondan osmiyuma bağlanan bir mordent olarak eklenir, protokolde daha sonraki bir aşamada daha fazla osmiyumun bağlandığı bir köprü görevigören 41. Uranyum tuzu olan uranil asetat, lipitler, nükleik asitler ve proteinler için etkili bir kontrast maddesidir, kurşun sitrat ise proteinlerin ve glikojenlerin kontrastını arttırır. Bu ajanların hücresel bileşenler için değişen yakınlıkları, osmiyum inkübasyonlarının üzerindeki ve üstündeki dokulardaki genel kontrastı daha da artırır42.

Blok Yüzünü Görüntüleme
Şekil 11, Şekil 12, Şekil 13 voltajın birleşik etkilerini, piksel durma süresini ve ışın yoğunluğunu göstermektedir. Geleneksel uygulama, numune bloğunun en iyi şekilde görüntülenmesi ve ışın hasarını önlemek için düşük voltaj, kısa bekleme süresi ve düşük ışın yoğunluğunun bir kombinasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir. Bu ayarların aksine, Şekil 11, Şekil 12, Şekil 13, daha yüksek voltajların (örneğin, 7 kV), daha uzun bekleme sürelerinin (32 μs / px) ve daha yüksek kiriş yoğunluklarının (bizim durumumuzda 6 ayarı) geleneksel ayarlara göre üstün görüntü kalitesi üretebileceğini göstermektedir.

SBF-SEM, voksellerden oluşan bir 3D veri seti olarak toplanabilen seri elektron mikroskopi görüntülerinin toplanmasına izin verir. Bu, SBF-SEM'in inanılmaz derecede güçlü bir kullanımı olsa da, bu yöntem nadir biyolojik olayların veya hücrelerin hızlı ve tekrarlanabilir görüntülenmesini de sağlar. SBF-SEM kullanılarak görüntü alımı nadir olaylar için izlenebilir ve bu olayların daha yüksek büyütme/çözünürlük görüntülerini toplamak için görüntüleme duraklatılabilir. Ayrıca iletim elektron mikroskopisi (TEM) görüntüleme için blok mikroskop odasından ve blok-yüz kesitli bölümünden çıkarılabilir. Bu şekilde nadir olayların büyük veri kümeleri SBF-SEM kullanılarak toplanabilir ve TEM kullanılarak angstrom ölçeğinde takdir edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: Protokolün çeşitli adımlarında SBF-SEM ve TEM karşılaştırmaları. Bu protokol, numune dokusunun ağır metallerle boyandığı birden fazla adım içerir. Bu sadece doku kontrastını ve hücresel yapıların ve organellerin takdirini değil, aynı zamanda doku görüntülendiğinde ortaya çıkan şarj seviyelerini de etkiler. Bu şekil, hazırlanan dokunun üç farklı görünümünü içerir: düşük büyütme görünümü (A, D ve G), yüksek büyütme görünümü (B, E ve H) ve hazırlanan fare korneasının TEM karşılaştırması (C, F & I). Elektron ışını daha küçük bir doku bölgesinde yoğunlaştığı için daha yüksek büyütme görüntülerinin doku şarjının artmasına neden olabileceği belirtilebilir. Üst sıra (A-C) adım 1.8 tamamlanması ile işlenen dokudan alınan temsili bir örnektir ve potasyum ferrosiyanid, osmiyum tetroksit ve tiyokarbohidrazid ile emprenye edilmiştir. İlk iki sütundaki oklar referans noktası olarak epitel-stromal arabirimi gösterir. Alt iki satıra kıyasla düşük kontrast seviyesine ve artan doku şarj seviyelerine dikkat edin. Orta sıradaki örnek (D-F) adım 1.10'un tamamlanmasıyla işlendi ve ek bir osmiyum tetroksit adımından yararlanır ve üst sıradaki örnekten gözle görülür şekilde daha zıttır. Hücresel yapılar ayırt edilebilir olsa da, şarj hala mevcuttur. Alt sıradaki örnek(G-I)tam boyama protokolünden yararlanır ve minimum doku şarjı özelliğine sahiptir. TEM görüntüleme, her adımda (sağ sütunda) bulunan ağır metallerin verdiği doku kontrast seviyelerini ortaya koymaktadır: kornea endoteldeki (*) organeller, protokol yoluyla doku işleme devam ettikçe daha kontrastlı ve belirgindir. Ek olarak, protokol tamamlandıkça stromal kollajen ve fibrilin ayrıntıları daha görünür hale gelir (ok ucu). Panel A, D & G ölçek çubuğu = 50 μm. Panel B, E & H ölçek çubuğu = 10 μm. Panel C, F & I ölçek çubuğu = 1 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Gömülü doku bloğunun şeması, numune pimi ve son hazırlık. (A) Doku, reçine kalıbının en ucunda ve karbon siyah doymuş reçine ile dolu kalıbın üst üçte birine bilinen bir yönde yerleştirilmelidir. Kalıbın dokudan en uzak bölgesi açık kalmalıdır, böylece deney etiketi açıkça görülebilir. (B) Bir ızgara deseni üretmek için numune pim yüzeyi çizilmelidir, bu, siyanoakrilat tutkalın hazırlanan numune bloğu ve pim arasında sertleşmesi için daha geniş bir temas alanı sağlar. (C) Karbon siyah doymuş reçine, numune pim kafası ile geniş bir temas alanı yapmalıdır, ancak elmas bıçak tarafından kesilen bölge 1x1 mm'den büyük olmamalıdır. Bloğu ucuna doğru sivrilemek iyi bir uygulamadır. Bu, elmas bıçak üzerindeki kesme kuvvetlerini en aza indirir ve daha geniş bir tabana sahip olarak, blok kesit sırasında pimden ayrılmaya karşı daha dayanıklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Görüntü yakalama ayarlarının karşılaştırılması. ( A &B) Paneller A ve B piksel durma süresinin bir işlevi olarak görüntü kalitesini ve çözünürlüğünü karşılaştırır. Panel A, 4 kV'da 32 μs/ piksel durma süresi kullanılarak oluşturulmuştur ve genişlemiş girişin "grenli" görünümünde belirgin olduğu gibi azalmış bir sinyalden gürültü oranına sahiptir. Panel B, 4 kV'da 100 μs/piksel durma süresi kullanılarak oluşturulmuştur. Piksel durma süresini artırmak sinyali gürültü oranına yükseltir ve hücresel ayrıntı seviyesinin arttığını ortaya çıkarır, ancak artan piksel durma süresi, bloğu yumuşatan ve bölümleme sırasında kesme eserlerini (gevezelik) tanıtan doku şarjı ve / veya ısı birikmesine yol açma potansiyeline sahiptir. C ve D panelleri, aynı pozlama koşullarında yakalanan görüntüleri iki farklı ışın kV değeriyle karşılaştırır. Bu panellerdeki doku, ışın penetrasyon derinliklerindeki farklılıkları daha belirgin hale getirmek için altın tonlu nanogold parçacıkları ile emprenye edildi. Panel C 9 kV'da, panel D ise 21 kV'da yakalandı. Artan kV, artan kontrast (D) avantajına sahiptir, ancak daha büyük bir doku derinliğinden(C)elektronların toplanması sonucu ayrıntılar kaybolur. Daha büyük bir kesiti örneklemenin bir sonucu olarak, GAP 43'e özgü daha fazla sayıda immünogold partikülü görünürken, spesifik olmayan etiketleme aynı kalır ve bu da sinyal-gürültü oranının artmasına neden olur. Panel A &B ölçek çubuğu = 2 μm. Panel C & D ölçek çubuğu = 1 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Işın yoğunluğu, kV ve spot boyutu. (A) Doku örneğine temas ettikten sonra, elektron ışını (açık mavi), ışın elektronları ile doku örneği arasındaki etkileşimden değişen enerji formlarının üretildiği gözyaşı şeklinde bir etkileşim hacmi sağlar. Gözyaşı şekli, ışın enerjisi ve elektron ışınının eğim açısı43ile birlikte doku yoğunluğu ve ağır metal boyama işlevidir. SBF-SEM görüntüleme sırasında x-ışınları, burgu elektronları ve üçüncül elektronlar üretilirken, birincil endişe geri saçılmış (koyu mavi) ve ikincil (yeşil) elektronlar13. SBF-SEM görüntüleme ile üretilen görüntü, geri saçılmış elektronların toplanmasıyla üretilir. Bu elektronlar ışın ve örnek arasındaki elastik etkileşimlerden kaynaklanır ve toplanan sinyal, etkileşime giren atomların atom sayısına oldukça bağlıdır - bu nedenle ağır metal boyama ihtiyacı44. İkincil elektronlar ışın ve numune arasındaki inelastik etkileşimlerden kaynaklanır ve sinyallerinin algılanmasının yüzey yönüne oldukça bağlıdır. SBF-SEM'de blok yüz düz olduğundan, ikincil elektronlar toplanan sinyale anlamlı bir katkı sağlamaz13. Aslında, bloğun yüzeyinde ikincil elektron birikimi önemli bir şarj kaynağı olabilir ve görüntü kalitesi üzerinde zararlı bir etkiye sahiptir2. (B) Bu grafik ışın yoğunluğu, ışın kV ve spot boyutu arasındaki ilişkiyi gösterir. Spot boyutu kirişin uzamsal çözünürlüğüdür ve üretilen görüntülerin çözünürlük sınırını belirler. kV'nin düşürülmesi spot boyutunu artırır, aynı zamanda görüntüleme derinliğini azaltarak detayın daha iyi takdirini sağlar. Bu, algılanabilir sinyali de azaltma etkisine sahiptir. Artan ışın yoğunluğu, nokta boyutu ve sinyal algılamada ilk iyileştirmeyi sunar, ancak doku şarj seviyelerini hızla arttırır. Sonuçta, seçilen ışın yoğunluğu ve kV değerleri numuneye bağımlıdır ve sorulan bilimsel soru ile ilgili olarak ampirik olarak en iyi şekilde belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Fare korneasında elastin içermeyen mikrofibril demet ağı. Kornea stroma içindeki keratositlerle (sarı, turuncu ve yeşil) yakından ilişkili mikrofibrillerin (beyaz) 3D rekonstrüksiyonu. Mikrofibriller kornea keratositlerine (oklar)(A)bitişik olarak ve bazı durumlarda sığ oluklar içinde görülebilir. Bu elastin içermeyen mikrofibril ağı kornea stroma (B)içinde farklı katmanlarda düzenlenir. Ölçek çubuğu = 2 μm. Yeniden yapılandırıldı görüntü bloğu x & y ekseninde 45x45 μm ve voxel 22x22x100 nm çözünürlüğe sahip z ekseninde 30 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Stromal-epitel sınırda bazal laminden geçen kornea sinirlerinin rekonstrüksiyonu. Bazal laminadan (yeşil) geçerken nüfuz eden bir sinirin (mor) 3D rekonstrüksiyonu. Bu sinirin penetrasyondan önce çatallanma yaptığı görülebilir. Epitel içine nüfuz ettikten sonra, her iki sinir dalı da çarpma geçirdi. Mitokondri (sarı) sinir demetinin stromal ve epitel kısımlarında görülebilir. Ölçek çubuğu = 2,5 μm. Yeniden yapılandırıldı görüntü bloğu x & y ekseninde 25x25 μm ve z ekseninde 12x12x100 nm voksel çözünürlüğe sahip 14 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Limbal vaskülat ve periferik fare korneasındaki ilişkili hücreler. Bir damarın, sinir demetinin ve ilişkili hücrelerin seyahat ettiği 3D görüntü bloğundan (B) tek bir görüntü (A) görülebilir. Panel C, endotel hücre bağlantılarını kaplayan, etrafına sarılmış ilişkili bir perisit (gri) ile yeniden yapılandırılmış bir kap (kırmızı) gösterir. Bir sinir demeti (mavi) dokuda ilerlerken bu damara yakın bir yerde çatallanır. Bir nötrofil (sarı), hücre gövdesinde görülebilen polimorfik çekirdeği ve görüntünün sağına doğru bir çıkıntı olarak görülebilen sondaki uropod ile damarın uzun eksenine paralel olarak görülebilir. Geminin alt tarafında bir mast hücresi (macenta) görülebilir. Panel D, granüllerinin (yeşil) hücre içindeki çekirdeği (mor) kaplarken daha kolay görülebildiği bu mast hücresini izole eder. Panel E, hücresel rekonstrüksiyonlarda üst üste binen hücresel yapıları vurgular, endotel çekirdekleri mavi ile gösterilir ve damar lümeninde (turuncu) görülebilen yapışık mikropartiküller bulunur. Oklar, endotel hücreleri arasındaki hücre-hücre sınırlarını gösterir, bu da damarın aydınlık tarafındaki hücreler boyunca uzanan yükseltilmiş sırtlar olarak görülebilir. Panel A ölçek çubuğu = 2 μm. Bu hücreleri yeniden oluşturmak için kullanılan görüntü bloğu x & y ekseninde 30x30 μm ve z ekseninde 14.6x14.6x100 nm voksel çözünürlüğe sahip 42.5 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: İnsan olmayan primat retinal sinir lifi tabakasının damar ağı yeniden yapılandırılmıştır. (A) Primat retinanın 8192x8192 px'te çekilen 200x200 μm SBF-SEM görüntüsü. Örnek alınan konum, patolojisi olmayan sağlıklı bir gözün alt zamansal kenar boşluğundan ~500 mikrondur. C & D panellerinde yeniden yapılan görüntü serisi 2048x2048 px'te çekildi ve görüntüleme duraklatıldı, böylece ilgili bölgeler 8192x8192 px'te görüntülenebiliyordu. Panel B, doğrudan orijinal görüntüden alınan Apanelinin kakma bölgesidir. Çok sayıda akson ve mitokondrilerine dikkat edin. (C) Bir kontrol gözü alt temporal sinir lif tabakasının 200x200x200 μm doku hacminden geçen ve vaskülat parçalanmış ortoslice bölümü. (D) Sinir lifi tabakası vaskülatının Z-projeksiyonu. Bu seri, bu metodolojiyi kullanarak geniş bir alanda mümkün olan çözünürlüğü gösterir. Panel A ölçek çubuğu = 20 μm. Panel B ölçek çubuğu = 2 μm. Görüntü serisi voxel çözünürlük 97.6x97.6x500 nm'dir. İlgi alanı piksel çözünürlüğü 24.4x24.4 nm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Dev danio(Devario malabaricus)kompakt kalbindeki damarların segmentasyonu ve 3D hacimli işleme. (A) Bir görüntü yığınında, merkezi venular boyutlu bir geminin (ok) ve endotel çekirdeğinin (ok ucu) profilini gösteren, mitokondri bakımından zengin ve iyi organize edilmiş sarkokenler (*) ile çevreleyen kardiyak miyositlerin profilini gösteren iki boyutlu mikrografi. (B) Kılcal damar (ok) ile görüntü yığınının iki boyutlu mikro grafiği. (C) Bir ortogonal dilimden yansıtılan B panelinde kılcal damarı gösteren mikrograf yığınının biyorthogonal projeksiyonları. (D) Yeniden inşa edilen damarı kaplayan parçalı endotel hücrelerinin 3D işlenmesi. Yeşil, kırmızı, mavi ve mor renklerde gösterilen dört ayrı endotel hücresidir; mavi ile gösterilen endotel hücresi B panelinde (ok) kesitte görülebilirken, kırmızı (ok) ve yeşil (ok ucu) ile gösterilen endotel hücreleri panel A. Paneller A & B ölçek çubuğu = 2 μm'de kesitte görülür. Yeniden yapılandırıldı görüntü bloğu x & y ekseninde 30x30 μm ve z ekseninde 14.6x14.6x100 nm voksel çözünürlüğe sahip 16 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Görüntüleme komplikasyonları ve eserler. (A) Bu görüntünün dalgalı ve bozuk doğası, çok uzun bir piksel bekleme süresi kullanılarak görüntülemenin sonucudur. Bu, reçine bloğunu ısıtır ve blok yüzünü yumuşak ve lastik gibi bırakır ve bu da kesim sırasında bozuk bir görüntüye neden olur. (B) Bu resim bir dizi eser içerir. Yıldız işareti, daha yüksek bir büyütmede önceki görüntülemenin neden olduğu dalgalı bir bozulmayı gösterir ve panel A'ya benzer , kirişi daha uzun piksel bekleme süresine sahip daha küçük bir bölgeye yoğunlaştırmak, bu ilgi çekici bölgedeki reçineyi yumuşatmıştır. Toplanan daha yüksek büyütme görüntüsü eserler içermese de, bu, ilgi çekici bölgenin altında kalan örneğin bozuk göründüğü sonraki bir dizi görüntüye yol açabilir. Bu panel ayrıca, görüntüleme sırasında blok yüzünde (ok) enkaz birikmesi sorununu da göstermektedir, ayrıca Epanelinde okla gösterilir. Bu kalıcı bir görüntüleme sorunu haline gelirse, vakumun kırılması, odanın açılması ve elmas bıçakta ve numunenin etrafında biriken kalıntıların üflenilmesi gerekecektir. Elektronların blok yüzünden küçük deşarjları, beyaz ok ucu tarafından belirtilen hızlı kontrast değişikliklerine ve çizgilere yol açabilir. (C) Bu görüntüde blok yüzündeki bıçak çizikleri gösterilmektedir. Bu, hasarlı bir bıçak veya bıçağın kenarındaki döküntü birikimi nedeniyle oluşabilir. (D) Belirtilen eser (ok), numune hala görüntüleme odasındayken uzun bir süre boyunca blok yüze odaklanan (bölümlemeden) elektron ışınının bir sonucudur. (E) Dokunun yanlış sabitlenmesi hücresel yapıların ve bağ dokusunun ayrılmasına neden olabilir (*). (F) Dokunuzda veya reçine bloğunuzda büyük miktarda şarj meydana gelirse, sonraki birikim ve akıntı meydana gelebilir ve bu da görüntünün bu görüntüde görüldüğü gibi "atlanmasına" neden olur. Bu atlama noktalarında (oklar) görüntüdeki dokunun bozulmasına dikkat edin. Panel A ölçek çubuğu = 1 μm. Panel B ölçek çubuğu = 2 μm. Panel C ölçek çubuğu = 5 μm. Panel D ölçek çubuğu = 2 μm. Panel E ölçek çubuğu = 25 um. Panel F ölçek çubuğu = 50 um. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 11
Şekil 11: Çeşitli piksel bekleme süreleri ve ışın yoğunlukları kullanılarak 3 kV'da görüntüleme dokusu. Tüm görüntüler 3 kV ışın kullanılarak toplanıyordu, ışın yoğunluğu 1 ila 20 arasında değişen cihaza özgü bir ölçekte. Görüntülenmiş alan beyaz ve kırmızı kan hücreleri içeren vasküler lümendir. Bu düşük kV'de hücresel ayrıntıyı takdir etmek zordur. Piksel durma süresini artırmanın çok az etkisi oldu. Işın yoğunluğunu 6 gelişmiş görüntü kontrastı'na yükseltin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 12
Şekil 12: Çeşitli piksel bekleme süreleri ve ışın yoğunlukları kullanılarak 7 kV'da görüntüleme dokusu. Tüm görüntüler 7 kV ışın kullanılarak toplanmıştır, ışın yoğunluğu 1 ila 20 arasında değişen cihaza özgü bir ölçektedir. Görüntülenmiş alan beyaz ve kırmızı kan hücreleri içeren vasküler lümendir. 7 kV'da, artan ışın yoğunluğu ve piksel durma süresi daha yüksek kaliteli görüntülemeye katkıda bulundu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 13
Şekil 13: Çeşitli piksel bekleme süreleri ve ışın yoğunlukları kullanılarak 12 kV'da görüntüleme dokusu. Tüm görüntüler 12 kV ışın kullanılarak toplanmıştır, ışın yoğunluğu 1 ila 20 arasında değişen cihaza özgü bir ölçektedir. Görüntülenmiş alan beyaz ve kırmızı kan hücreleri içeren vasküler lümendir. 12 kV'da görüntüleme, piksel durma süresi ve ışın yoğunluğu ayarlanarak optimize edilir. Hücresel ayrıntı ve görüntü kontrastı daha uzun piksel bekleme süresi ve daha yüksek ışın yoğunluğu ile en iyisiyken, daha kısa piksel bekleme süreleri arasında şarj azalır/yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntemlerin amacı, laboratuvarımızın yüksek çözünürlüklü seri elektron mikroskopi görüntülerini güvenilir bir şekilde yakalamasını sağlayan doku hazırlama ve görüntüleme metodolojisini vurgulamak ve SBF-SEM görüntülemesini yaparken oluşabilecek potansiyel tuzakların yanı sıra bu sonuca yol açan kritik adımlara dikkat çekmektir. Bu protokolün kullanılmasındaki başarı, dokunun düzgün bir şekilde sabitlenmesi, ağır metallerin numuneye emprenye edilmesi, şarjı azaltmak için gömme reçinesinin değiştirilmesi ve görüntüleri toplamak için kullanılan mikroskop ve görüntüleme ayarlarının anlaşılmasını gerektirir. Maksim, "kalite içeri, kalite dışarı" SBF-SEM görüntüleme için uygun bir aksiyomdur. SBF-SEM'in amacı genellikle ultrayapısal detayların değerlenmesi veya ölçülmesi olduğundan, doku bozulmasının oluşmaması için fiksasyon stratejisine ekstra özen gösterilmelidir. Doku, örneklerin hazırlanmasında herhangi bir noktada bozulursa (yani hücresel morfolojinin şişmesi, küçülmesi veya bozulması) durumunda, doku rekonstrüksiyonu ve nicelizasyonu doğru veri vermez. Ayrıca, yanlış görüntüleme ayarlarının kullanılması, SBF-SEM görüntüleme yıkıcı bir süreç olduğu için tekrar yakalanamayan veri kaybına yol açabilir. Ayrıca, hassas elmas bıçağı acele veya yanlış numune hazırlamadan zarar görebilebileceği için bir doku örneği yüklenirken dikkatli olunmalıdır. Bu, bıçakta talaşlara veya kırılmalara neden olabilir, bu da görüntülerde görünür çizik izleri bırakabilir (Şekil 10C). Elmas bıçak ayrıca kireçlenmiş yapılar, sert granüller veya yanlışlıkla gömülü cam (örneğin, reaktif ampullerden) tarafından da zarar görebilirsiniz.

Bugüne kadar SBF-SEM literatürlerinin çoğunluğu 1-5 μs/px'e yakın piksel bekleme sürelerinin yanı sıra 1 ila 3 kV aralığında ışın ivmesi voltajları kullanırken (Şekil 11)45,46,47,48,49, akım protokolü 7-12 kV hızlanma voltajları ve seri görüntüleme için 12 μs / px ve ilgi alanlarını görüntüleme için 32 μs / px piksel bekleme süresi kullanır (Şekiller 12 & 13). Bu ayarlar, 100-200 nm'lik bir dilim kalınlığı ile birleştiğinde, çok çeşitli biyolojik dokunun yüksek kaliteli ve yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar. Artan hızlanma voltajı kontrast, çözünürlük ve sinyal-gürültü oranında artış sağlar. Artan durma süresi çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını daha da artırırken, artan dilim kalınlığı kesitleme sırasında blok yüzeyinde şarjın azalmasına neden olur ve sonraki görüntülerde ışın kaynaklı hasarla mücadele eder14. Bu görüntüleme yöntemi kuraldan farklı olsa da, üretilen görüntüler ve veri kümeleri kendileri için konuşur. Bu başarının nedeni hakkında spekülasyon yapmak zorunda kalırsak, yüksek kV değerlerinin, daha uzun piksel bekleme sürelerinin ve blok hazırlığının benzersiz kombinasyonunun bir sonucu olabilir. Görüntüleme kV'nin artırılması, elektron ışını ile numune arasındaki etkileşim hacminin artmasına neden olur. Bu etkileşim hacmi hem daha derin hem de daha geniştir, bu da tespit edilen elektron sayısında, örnek bloğun daha derinlerinden veya nokta boyutu gözyaşı damlasının çapı arttıkça dokunun daha geniş bir kesitinden kaynaklanan teorik bir artışa neden olmaktadır. SBF-SEM bloğun yüzey detayı ile ilgilendiğinden, bu sinyal-gürültü oranında teorik bir düşüşe neden olur. Bununla birlikte, kV'deki artış, elektronları bloktan kaçma olasılıklarının daha düşük olduğu ve dedektör tarafından toplanan elektronlara katkıda bulunma olasılıklarının daha düşük olduğu numunenin daha derinlerine itmektedir. Daha uzun piksel bekleme süreleri ve daha yüksek ışın yoğunluğu ile artan bir sinyalin ek yararı ile, bu görüntüleme yönteminin etkileşim hacminden kaynaklanan gürültü ile ilgili olarak örnek yüzeyden gelen sinyalde daha fazla artışa neden olması mümkündür. Ek olarak, karbon siyahı yanı sıra gümüş ve altın kaplama ile sunulan artan numune iletkenliği, artık blok içinde ve blok yüzünden daha derinlerde meydana gelen yük birikimini iyileştirmeye yardımcı olur. doğrusu Şekil 11, Şekil 12, Şekil 13 kV arttıkça numune şarjı, potansiyel olarak bloğun daha derinlerine itildikçe azalmaya başlar. Düşük büyütmede görüntülenmiş örnekler, geleneksel ayarlar kullanılarak yeterli kontrastla yakalanabilir, ancak bu görüntüler genellikle yakın incelemede ayrıntıdan yoksun olur. Verilerimiz, hedefin hücresel ayrıntı olduğu nispeten yüksek büyütme kullanırken, geleneksel ayarların artırılmasının olağanüstü sonuçlar doğurabileceğini açıkça göstermektedir. P. Goggin'in 2020 makalesi, ve diğerleri, görüntüleme ayarlarını değiştirmenin nihai görüntü kalitesi üzerindeki etkisini özetleyen yararlı bir tablo sağlar ve yeni dokular için protokolü optimize etmek gerekli hale gelirse danışmak için yararlı bir referanstır.14. Bu protokolde önerilen 100-200 nm dilim kalınlığı, büyük SBF-SEM veri kümelerinin hızlı bir şekilde toplanmasına izin verme avantajına sahiptir. Örneğin 12μs/px'te görüntü toplarken, 2048x2048 px'te 100 μm derinlikte görüntüleme, 100nm/ bölümde bölümlenirken ~14 saat gerektirir, ancak 25nm / bölümde bölümlenirse ~ 56 saat gerektirir. x,y çözünürlük kesit kalınlığının bir sonucu olarak değişmeden kalırken, daha yüksek kV değerleri ve daha büyük bölümlerle birlikte gelen piksel bekleme sürelerini kullanarak görüntü oluşturma yeteneğini hesaba katmasa da, z ekseni boyunca çözünürlüğün zarar çektiğini belirtmek önemlidir. Z-çözünürlük kaybı önemli bir husustur ve dokunun reçine bloğunda ve görüntüleme düzlemi ile ilgili olarak nasıl yönlendirilmesi gerektiğine karar verirken düşünülmelidir ve daha küçük hücre özelliklerinin veya etkileşimlerinin (örneğin, onlarca nanometre ölçeğinde sinaptik invaginasyonlar veya hücre içi özellikler) incelenmesini engelleme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, hızlı görüntüleme süresine ek olarak, bu protokolün, nadir biyolojik olayların veya hücrelerin incelenmesinin yanı sıra stereolojik analiz için ideal veri kümelerini hızla üretmesi için ek faydaları vardır. Daha büyük kesit kalınlığı manuel 3D rekonstrüksiyonda da yardımcı olabilir, çünkü 100 nm/ bölümde bölümlenmiş 100 μm'lik bir bölge 1.000 görüntünün manuel olarak segmentasyonunu gerektirirken, aynı bölge 25 nm / bölümde bölümlenmiş 4.000 görüntünün manuel olarak segmentasyonunu gerektirir.

SBF-SEM, nispeten kısa bir süre içinde büyük veri kümeleri oluşturma avantajına sahiptir. Aşağıda tartışılacak olan stereolog gibi nicel yöntemler kullanılarak veri analizi yapılabilirken, genellikle görüntü segmentasyonu yoluyla 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak bilgilendirici olabilir. SBF-SEM kullanılarak oluşturulan bir görüntü yığını voksel koleksiyonu olarak düşünülebilirken, segmentasyon bu vokselleri kullanıcı tanımlı nesnelere atama işlemidir ve böylece doku yapılarının 3D gösterimlerini oluşturur. Bu rekonstrüksiyonlar genellikle doku ultrayapısı ve hücre-hücre etkileşimi hakkında daha önce görülmemiş bir bakış açısı sağlar (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8, Şekil 9). Ayrıca, rekonstrüksiyonlar oluşturulduktan sonra, segmentlere ayrılmıştır dokudan zengin bir bilgi çıkarmak için rekonstrüksiyonların doğasında bulunan verileri kullanmak mümkündür. Yüzey alanı, hacim, uzunluk ve mesafe ile açısal veriler arasında değişen parametrelerin tümü, bir yeniden yapılandırma oluşturulduktan sonra kolayca kullanılabilir50,51. Bu, özellikle yeniden yapılandırılmış veri kümelerinden çekilen video ve görüntülerle eşleştirildiğinde inanılmaz derecede yararlı olsa da, SBF-SEM veri kümelerinden veri tahmin etmeye çalışırken manuel segmentasyon için gereken süre önemli bir husustur. Şu anda SBF-SEM görüntü yığınlarının manuel ve yarı manuel segmentasyonu için hem ücretsiz hem de satın alınabilir bir dizi yazılım bulunmaktadır. Rekonstrüksiyon yazılımı için ücretsiz bir seçenek, manuel segmentasyona izin veren bir segmentasyon düzenleyici eklentisi içeren açık kaynaklı bir görüntü işleme programı olan ImageJ için görüntü işleme paketi Fiji52,53. Ek olarak, yazılım Reconstruct alternatif bir ücretsiz segmentasyon seçeneği sunar54 (Şekil 8). Potansiyel olarak pahalı olsa da, satın alabilir seçenekler genellikle yarı otomatik segmentasyon işlemleri veya film ve görüntü oluşturma paketleri gibi daha sağlam özellik kümeleri içerir. Şekil 5 , Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 9'da (Ayrıntılar Malzeme Tablosundamevcuttur) bulunan rekonstrüksiyonları oluşturmak için böyle bir seçenek kullanılmıştır. Ayrıca, yeniden yapılandırma sürecini büyük ölçüde hızlandırma potansiyeline sahip sanal gerçeklik kullanılarak kontrast tabanlı 3D rekonstrüksiyonların oluşturulması, analizi ve işlenmesi için araçlar mevcuttur20,55. Tüm uygulamalar için her zaman mevcut olmasa da, segmentasyon56 , 57,58için gereken süreyi büyük ölçüde azaltma potansiyeline sahip bilgisayar destekli manuel segmentasyon için bir dizi yazılım aracı mevcuttur. Kullanılan yazılımdan bağımsız olarak, önemli ölçüde öngörü ve cevaplanan sorunun anlaşılması veya seri rekonstrüksiyonlarla doldurulacak bilgi boşluğu, süreç zahmetli ve zaman yoğun olduğu için segmentasyondan önce gelmeli.

3D rekonstrüksiyonların üretimi kendi dikkate alınması gereken hususlarla birlikte gelir. Daha büyük veri kümeleri ile işlem gücü sınırlayıcı bir faktör olabilir ve bu nedenle sistem kaynaklarının kullanımını optimize etmek üretken bir iş akışını sürdürmek ve yeniden yapılandırma ve işleme sürecini hızlandırmak için kritik olabilir. 3D yeniden yapılandırma oluştururken, çoğu yazılım parçalı görüntü yığınlarını birbirine bağlı üçgenlerden oluşan bir yüzeye dönüştürür. Bir yeniden yapılandırma projesi büyük veya karmaşıksa, bu üçgenlerin işlenmesi çok fazla bilgi işlem gücü gerektirebilir. 3D rekonstrüksiyon üzerinde çalışırken, rekonstrüksiyon yazılımının parçalanmış görüntüleri yeniden yapılandırılmış yüzeylere dönüştürmek için kullanabileceği üçgen sayısını sınırlamak yararlı olabilir. Bu, segmentasyon işlemi sırasında bir 3D yeniden yapılandırmanın ilerlemesini izlemek için yararlı olabilir. Segmentasyon tamamlandıktan sonra, yeniden yapılandırma görüntülerini veya videolarını oluşturmadan önce üçgen sınırı kaldırılabilir. Alternatif olarak, ve yeniden yapılandırma yazılımı buna izin veriyorsa, yüzey üretimi yerine hacim oluşturma kullanarak bir yeniden yapılandırmanın ilerlemesini izleme başarısı bulduk. Ses düzeyi oluşturma, yayın veya sunum için amaçlenen görüntüler veya videolar için uygun olmasa da, çok daha az işlem gücü gerektirir ve bu nedenle yeniden yapılandırma görüntülerini ve videolarını yeniden inşa ederken ve hazırlarken sorunsuz bir deneyim sağlamada yardımcı olabilir. Ayrıca, yeniden yapılandırılacak her nesneyi kendi benzersiz tanımlayıcısıyla tanımlamak için bir SBF-SEM veri kümesini el ile segmentlere ayırırken en iyi uygulamadır. Örneğin, tüm epitel hücrelerini "epitel" başlıklı bir voksel gruba atamak yerine, bir epitel hücresi alanı yeniden inşa ediliyorsa, her epitel hücresine kendi adı atanmalıdır (örneğin, Epi1, Epi2, Epi3, vb.). Her hücre son işleme dahil edilebilir veya dışlanabilir, farklı renkler veya asetatlar atanabilir veya bir video üretiliyorsa ayrı ayrı kaldırılabilir veya tanıtılabilir, bu da yeniden yapılandırma tamamlandığında daha fazla özgürlük sunar. Ayrıca, bu, yüzey alanı veya hacim gibi ölçümlerin bir bütün olarak nesne grubu yerine yeniden yapılandırılmış her nesneden toplanmasına izin verir.

SBF-SEM görüntü yığınlarından nicel verileri ayıklamak için inanılmaz derecede güçlü bir başka araç da stereoloji uygulamasıdır. Stereoloji, üç boyutlu nesneler ve bunların iki boyutlu gösterimleri (yani elektron mikrografları) arasındaki doğal matematiksel ilişkilerden yararlanır. SBF-SEM veri kümeleri stereolojinin uygulanması için idealdir, çünkü büyük veri kümelerinden 3D bilgileri ayıklamak için bu yöntem, segmentlere ayrılmıştır yeniden yapılandırmaya kıyasla önemli ölçüde daha az zaman ve emek yoğundur. Stereoloji genellikle rastgele, düzgün örneklenmiş görüntülere geometrik ızgaraların uygulanmasından oluşur ve hücre / organel sayısı, uzunluğu, yüzey alanı ve hacim 21, 59, 60 ,61 , 62,63'ün doğru ve tarafsız tahminlerini üretmek için son50yılda yoğun olarak kullanılmıştır. 3D rekonstrüksiyonlar etkileyici olabilir ve biyolojik dokulara yeni bir bakış açısı sağlayabilirken, büyük örnek boyutlarının veri ayıklamaya stereolojik bir yaklaşım kullanması genellikle daha hızlı, daha doğru, tekrarlanabilir ve elverişlidir. Stereolojinin pratik uygulamasını tartışan birçok makale olsa da64,65,66, bir dizi ders kitabı metodolojiye yararlı, derinlemesine genel bakışlar sağlar ve doku ultrayapısı 67 , 68,69çalışmasına uygulanabilecek bir dizistereolojikızgara sağlar.

SBF-SEM, doku ultrayapısının üç boyutlu olarak takdirini sağlayan güçlü bir görüntüleme yöntemidir. SEM çözünürlüğü ile 3D veri kümeleri oluşturma yeteneği daha önce cevaplanamayan soruları erişimimize sokarken, bu mikroskopi yöntemini kullanan çalışmaların başarısı için uygun doku hazırlama ve SBF-SEM görüntüleme anlayışı çok önemlidir. Bu protokolün gelecekteki çalışmalara uygulanmasının, bizi çevreleyen biyolojik gizemler hakkında daha fazla ve daha fazla içgörüye yol açacağını ve bizi insan bilgisinin sınırlarına daha fazla itmeye devam edeceğini umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown ve Margaret Gondo'ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 EY-018239 ve P30 EY007551 (Ulusal Göz Enstitüsü), kısmen Lion's Foundation for Sight ve kısmen NIH 1R15 HD084262-01 (Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

Biyoloji Sayı 169 Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi SBF-SEM 3D-EM 3D-Rekonstrüksiyon Doku Hazırlama Numune Hazırlama Seri Bölümler Ultrayapı Yüksek Çözünürlüklü Hacimsel Görüntüleme Biyolojik Büyük Hacimli
Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter