Summary
På trods af fremskridt i multiplex immunohistochemistry og multispektral billeddannelse, karakterisere tætheden og klyngedannelse af store immunceller samtidigt i endometriet er fortsat en udfordring. Dette papir beskriver en detaljeret multiplex farvning protokol og billeddannelse for samtidig lokalisering af fire immuncelletyper i endometriet.
Abstract
Immunohistochemistry er den mest anvendte metode til identifikation og visualisering af vævsantigener i biologisk forskning og klinisk diagnostik. Det kan bruges til at karakterisere forskellige biologiske processer eller patologier, såsom sårheling, immunrespons, væv afvisning, og væv-biomateriale interaktioner. Visualiseringen og kvantificeringen af flere antigener (især for immunceller) i en enkelt vævssektion ved hjælp af konventionel immunhistokemisk (IHC) farvning er dog fortsat utilfredsstillende. Derfor blev multiplexed teknologier indført i de seneste år for at identificere flere biologiske markører i en enkelt vævsprøve eller et ensemble af forskellige vævsprøver.
Disse teknologier kan især være nyttige til at differentiere ændringerne i immuncelle-til-celle interaktioner inden for endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med tilbagevendende aborter under implantation. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for multiplexed fluorescens IHC farvning til at undersøge tætheden og klyngedannelse af fire store immuncelletyper samtidigt i præcist timede endometrieprøver under embryo implantation. Metoden omfatter prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med særlig henvisning til detektering af endometrieimmunceller.
Ved hjælp af denne metode kan tætheden og klyngedannelsen af fire store immuncelletyper i endometriet samtidig analyseres i en enkelt vævssektion. Derudover vil dette papir diskutere de kritiske faktorer og fejlfinding for at overvinde mulig fluorophore interferens mellem de fluorescerende sonder, der anvendes. Vigtigere er det, at resultaterne fra denne multiplex farvningsteknik kan hjælpe med at give en dybdegående forståelse af den immunologiske interaktion og regulering under embryoimplantatering.
Introduction
Tilbagevendende abort (RM) kan defineres som tab af to eller flere graviditeter før 24 ugers svangerskab1. Denne hyppige reproduktive tilstand påvirker op til 1% af par på verdensplan2,3. Patofysiologien er multifaktoriel og kan opdeles i embryologisk drevne årsager (primært på grund af en unormal embryonal karyotype) og maternally drevne årsager, der påvirker endometrium og / eller placental udvikling. Denne manifestation kan skyldes forældrenes genetiske abnormiteter, livmoderanomalier, prothrombotiske tilstande, endokrinologiske faktorer og immunologiske lidelser4.
I de senere år har immuneffektorcelledysfunktion været impliceret i patogenesen af tidlig graviditetstab5. Dette har inspireret mange undersøgelser af belyse de specifikke populationer af immunceller i endometriet under menstruationscyklus, implantation, og tidlig graviditet, med specifikke roller i den tidlige graviditet. Blandt disse immunceller spiller livmoder naturlige dræber (uNK) celler en afgørende rolle under embryoimplantation og graviditet, især i processerne for trofoblastic invasion og angiogenese6. Undersøgelser har vist en øget uNK-celletæthed i endometriet hos kvinder med RM7,8, selv om dette fund ikke var forbundet med en øget risiko for abort9. Dette stimulerede imidlertid forskning, der evaluerede tætheden af andre immuncelletyper (såsom makrofager, livmoderdendritiske celler) i endometriet hos kvinder med RM10,11. Ikke desto mindre er det fortsat usikkert, om der er en signifikant ændring i immuncelletætheden i peri-implantation endometrium hos kvinder med RM.
En mulig forklaring på usikkerheden er, at det kan være vanskeligt at vurdere den endometriske immuncelletæthed på grund af de hurtige ændringer i endometriet under implantationsvinduet. I løbet af 24 timers tidsrammen ændrer signifikante ændringer i endometrium immuncelletætheden og cytokinsekretionen, hvilket introducerer en kilde til variation i disse resultater12. Derudover er de fleste rapporter hovedsageligt afhængige af brugen af enkeltcellet farvning (f.eks. traditionelle IHC-metoder), der ikke kunne undersøge flere markører på samme vævssektion. Selvom flowcytometri kan bruges til at detektere flere cellepopulationer i en enkelt prøve, forhindrer de store mængder celler, der kræves, og den tidskrævende optimering populariteten og effektiviteten af denne metode. Derfor kan den seneste udvikling i multiplex IHC farvning løse dette problem ved at immunstaine flere markører på samme dias til at evaluere flere parametre, herunder celle afstamning og histologisk lokalisering af individuelle immun subpopulationer. Desuden kan denne teknologi maksimere de oplysninger, der opnås i tilfælde af begrænset væv tilgængelighed. I sidste ende kan denne teknik hjælpe med at belyse forskellene i immuncelleinteraktioner i endometriet mellem frugtbare kvinder og kvinder med RM.
To grupper af kvinder blev rekrutteret fra Prince of Wales Hospital, herunder frugtbare kontrol kvinder (FC) og kvinder med uforklarlige tilbagevendende abort (RM). Frugtbar kontrol blev defineret som kvinder, der havde mindst én levende fødsel uden nogen historie af spontan abort, og RM kvinder blev defineret som dem, der havde en historie af ≥2 på hinanden følgende aborter før 20 uger svangerskab. Forsøgspersonerne fra de to grupper opfyldte følgende inklusionskriterier: a) alder mellem 20 og 42 år, b) ikke-ryger, c) regelmæssig menstruationscyklus (25-35 dage) og normal livmoderstruktur, d) ingen brug af hormonelt regime i mindst 3 måneder før endometriebiopsi, (e) ingen hydrosalpinx ved hystero-salpingogram. Derudover havde alle de rekrutterede forsøgspersoner normal karyotyping, normal 3-dimensionel ultrasonografihysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerende hormon < 10 IE/L, mellem luteal progesteron > 30 nmol/L, normal skjoldbruskkirtelfunktion og testet negativ for lupus antikkoagulant og antikardiolipin IgG- og IgM-antistoffer.
For bedre at forstå rm's immunologiske grundlag ville det være mest ønskeligt samtidig at kvantificere og lokalisere de store immuncelletyper, der findes i endometriet på implantationstidspunktet. Dette papir beskriver hele protokollen fra prøveforberedelse, multiplexoptimering med markører for immuncelleundertyper og scanning af diasene efterfulgt af dataanalyse med specifik henvisning til detektering af endometrieimmunceller. Desuden beskriver dette papir, hvordan man bestemmer tætheden og klyngedannelsen af immuncelletyperne samtidigt i endometriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Informeret samtykke blev indhentet fra deltagerne, før de indsamlede endometriebiopsier. Se introduktionsafsnittet for integrationskriterier for kontrol- og RM-grupperne.
1. Prøveforberedelse
- Sørg for, at alle kvinder i denne undersøgelse gennemgår en daglig urin dipstick test fra dag 9 af menstruationscyklus og fremefter for at identificere luteiniserende hormon (LH) bølge til at opdage ægløsning, og tid endometriebiopsier netop på 7th dag efter LH bølge (LH +7).
- Få et 0,5 cm2 fragment af endometriebiopsi ved hjælp af en Pipelle-sampler eller pipet curet fra frugtbare kvinder og kvinder med uforklarlig RM. Mærk beholderen, og sæt straks prøven i 10 % neutral bufferet formalin (pH 7) til fiksering natten over ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Mængden af fikseringsativet skal være 5-10 gange så meget som for væv. - Placer vævet i en patron til dehydrering i en vævsbehandlingsmaskine, før du integrerer det i smeltet paraffinvoks. Vævene integres i paraffin ved 58-60 °C.
- Lad paraffinblokken køle natten over ved stuetemperatur. Brug en mikrotom til at trimme paraffinblokkene til en tykkelse på 3 μm.
BEMÆRK: Brugen af destillerede vandhjælpemidler i korrekt vævsmontering og tilslutning under multiplexfarvning. - Paraffinbåndet placeres i et vandbad ved 40-45 °C i 30 s.
- Sæt sektionerne på poly-L-lysin (0,1% w/v)-belagt mikroskop glas dias. Placer lysbillederne med vævet opad og lad det tørre ved 37 °C natten over. Opbevar diasene i en diaskasse væk fra ekstreme temperaturer, indtil de er længere brug.
2. Bestem den ideelle koncentration af antistoffer for multiplex IHC ved hjælp af konventionel IHC.
BEMÆRK: Dette er vigtigt for at identificere udtryksniveauet og mønsteret for hver immunmarkør i endometriumprøven og bestemme farvningssekvensen for hver markør samt deres tilhørende tyramidsignalforstærkning (TSA) fluorophoreparring.
- Test antistofferne for deres egnethed til multiplex IHC ved hjælp af manuel konventionel IHC13.
- Brug endometriumvæv til test af enkeltantistoffer.
- Medtag en positiv kontrol (f.eks milt) og negativ kontrol (isotype kontrol) til optimering af farvning tilstand af hvert antistof.
- Udfør farvningen ved hjælp af den fortynding, der anbefales af antistoffets dataark.
- Yderligere farvning ved hjælp af koncentrationer over og under den anbefalede fortynding, der blev anvendt i trin 2.3.
BEMÆRK: En klinisk patolog bør vurdere de farvede dias blindt for at bekræfte lokaliseringen af antistofsigtning og cellulær integritet.
3. Multiplex farvningsmetode
- Slideforberedelse og fiksering
- Rutsjebanerne (fra trin 1.6) lægges fladt med vævet opad i en ovn og bages ved 60 °C i mindst 1 time.
- Fjern rutsjebanerne fra ovnen, og lad dem køle af i mindst 20 minutter ved stuetemperatur, før de placeres i et lodret slidestativ.
- Devoks og rehydrere formalin-faste, paraffin-indlejrede dias med 10 min tildelt hver af følgende trin: xylen (2x), 100% ethanol (2x), 95% ethanol (1x), 70% ethanol (2x), og destilleret vand (2x).
- Placer rack af dias i en plastik slide boks og nedsænke dem i Tris-buffered saltvand (TBS, pH 7,6).
BEMÆRK: Diasene skal forblive fugtige fra dette rehydreringstrin, indtil de monteres i det sidste trin. - Prøverne fastgøres ved at nedsænke diasene i en plastikrutkasse fyldt med en blanding af formaldehyd fortyndet i methanol (1:9) i 30 min i mørke.
- Vask diasene to gange i deioniseret vand i 2 min og fortsæt derefter til antigenudtagning.
- Hentning af epitop
- Placer rack af dias i en varmebestandig kasse og fyldes det med citronsyre buffer (pH 6.0) til at dække dias.
- Placer kassen i mikrobølgeovnen, og varm rutsjebanerne i 50 s ved 100% strøm efterfulgt af 20 min ved 20% strøm for at opretholde samme temperatur.
- Lad lysbillederne køle af i ca. 15 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl rutsjebanerne i vand i 2 min efterfulgt af TBS-Tween 20 (TBST) i 2 min.
BEMÆRK: TBST består af 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl og 0,05% Mellem 20 (v/v).
- Blokering
- Bloker endogene peroxidaseaktivitet i vævet ved at nedsænke rutsjebanen på en krukke, der indeholder peroxidaseblokerende opløsning (se materialetabellen) i 10 min.
- Vask rutsjebanerne med TBST i 5 min.
- Brug en hydrofob barriere pen til at markere en grænse omkring vævssektionen på diaset.
- Vævssektionerne med en blokerende buffer (se materialetabellen) eller kvægserumalbumin (5 %, w/v) og inkuberes i et befugtet kammer i 15 min.
- Antistof- og signalapplikation
- Fjern de blokerende reagenser.
- Inkuberes med det primære interessestofstof (f.eks. CD3, 1:100 fortynding i antistoffortynding, se tabel 1) i et befugtet kammer ved stuetemperatur i 30 min.
- Fjern det primære antistof. Vask 3x med TBST i 5 min hver gang.
- Inkuberes med polymer peberrod peroxidase (HRP)-mærket sekundært antistof (tabel 1) i 15 min i et befugtet kammer ved stuetemperatur. Vask 3x med TBST i 5 min hver gang.
- Opalfluoriort TSA-arbejdsopløsningen (1:100 i forstærkningsfortynding) og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min for at muliggøre fluorophore-bøjning til vævsprøven på primære antistofbindingssteder. Vask med TBST i tredotel i 5 min hver gang.
- Mikrobølgebaseret stripning
- Skyl med antigenudtagningsbufferen (citratbufferopløsning, pH 6.0).
- Udfør mikrobølgebaseret stripning for at fjerne det primære-sekundære HRP-kompleks for at introducere det næste primære antistof (f.eks. CD20).
- Placer dias i antigen hentning buffer, mikrobølgeovn dem på 100% strøm i 50 s efterfulgt af 20% strøm i 20 min i mikrobølge-safe containere, og afkøle dem ved stuetemperatur i 15 min.
- Gentag trin 3.2.4 til 3.5.2, indtil vævsprøverne er blevet undersøgt med alle de primære antistoffer.
- Counterstain og montering
- Efter mikrobølgebaseret stripning og afkøling af antigenhentningsbufferen skylles lysbillederne i destilleret vand og TBST.
- Inkuberes med 4', 6-diamidino-2-phenylindoleopløsning (DAPI) (1,0 μg/mL) i 5 min i et befugtet kammer ved stuetemperatur.
- Vask 3x med TBST i 5 min hver gang. Vask med vand en gang i 5 min.
- Lufttørre rutsjebanen og monter med det relevante monteringsmedium (se materialetabellen).
BEMÆRK: Der kræves ikke modstang, for at monoplekse dias kan bruges til udvikling af spektralbiblioteker.
4. Billede og analyse
- Forberedelse af Spektral bibliotek dias
- Opret biblioteksdias (enkeltpletreferencebilleder) for hver fluorophore, DAPI og auto-fluorescens med det samme kontrolvæv til multispektral billedanalyse.
- Ved hjælp af leddiatene i endometribiopsiprøverne fra kvinder med RM og frugtbare kvinder skal du udføre trin 1.1 til 3.6.4 til påvisning af enkeltantistof for hvert dias (uden yderligere antistof eller fluorophortilsætning).
- For hver antistofdetektering skal du plette et af diasene med DAPI (som i trin 3.6.2) og lade et dias være ufarvet til påvisning af eventuel autofluescens i spektret.
- Brug de relevante filtre i arbejdsstationen til at hente billedet til dette sæt dias for hvert antistof og overføre dem til billedanalysebiblioteket (som beskrevet i trin 4.2).
- Når billedet er taget, skal du vælge iForm som Spektral bibliotekskilde og opbygge spektralbiblioteket.
- Når fluorophorer bruges, skal du vælge Pletter/Fluors...
- Mens du vælger pletter eller fluorophores, indsnævre valg ved at vælge en eller flere grupper. Vælg Alle for at få vist alle spektre, der er kompatible med billederne.
- Spektral billeddannelse
BEMÆRK: Billeder blev taget ved hjælp af Mantra Workstation med spektralbiblioteket etableret ved hjælp af inForm Image Analysis software.- Fang billedet af de enkelt-antistofplettede dias med de relevante epi-fluorescensfiltre som foreslået i tabel 2 (f.eks. DAPI, fluorescein isothiocyanate [FITC], CY3, Texas Red og CY5) ved hjælp af arbejdsstationen.
BEMÆRK: Anbefalede filtre til de specifikke fluorophorer, der anvendes i denne protokol, vises i tabel 2. - Identificer en passende eksponeringstid for et optimalt signal ved at undersøge hver markør i den tilsvarende fluorescenskanal.
BEMÆRK: Det optimale signal bestemmes i henhold til referencen på positivitet og lokalisering opnået i den enkelte antistoffarvning. - Bestem en fast eksponeringstid for hver analysand (antistof-fluorophore kombination) for at standardisere en krydsprøve sammenligning.
BEMÆRK: Fastsættelsen af den faste eksponering afhænger af intensiteten i stikprøven af interesser. - Scan de multiplex farvede dias i den relevante scanningstilstand med den integrerede autofokusalgoritme.
BEMÆRK: Det etablerede spektralbibliotek vil blive brugt til at differentiere den multispektrale billedkube i enkelte individuelle komponenter (spektral ublandet). Dette vil gøre det muligt at behandle den farvebaserede identifikation for alle interessemarkører ved hjælp af følgende to hovedtrin: træningssession og billedanalysesession.
- Fang billedet af de enkelt-antistofplettede dias med de relevante epi-fluorescensfiltre som foreslået i tabel 2 (f.eks. DAPI, fluorescein isothiocyanate [FITC], CY3, Texas Red og CY5) ved hjælp af arbejdsstationen.
- Billedanalyse
- Celletælling af udvalgte immuncelletyper i endometriet
- Fang mindst 10 felter til analyse under 200x forstørrelse.
BEMÆRK: Felterne blev optaget ved at scanne hele sektionen uden valg. Dette kan sikre samtidig fangst af alle cellekomponenter i endometriet, f.eks. den lysende epitelkant, stroma og kirtler. - Hvis du vil tælle cellerne, skal du klikke på knappen Tæl objekter på trinlinjen for at få vist panelet Indstillinger for objektoptælling.
- Markér afkrydsningsfeltet Kassér objekt, hvis du rører ved en kant, for at udelukke objekter, der berører kanten af billedet, procesområdet eller vævsområdet.
- Hvis vævet er segmenteret, skal du vælge den vævskategori, hvor objekterne skal findes. Tælle genstande uden for den valgte vævskategori.
- Vælg den ønskede fremgangsmåde for at identificere objekter: Objektbaseret eller Pixelbaseret (tærskel).
BEMÆRK: Pixel-Baseret (Threshold) tilgang bør vælges i tilfælde af en pålidelig eller konsekvent plet, for hvilken anvendelsen af en simpel tærskel vil give objektet pixels. Den objektbaserede tilgang anbefales, når der kræves mere avancerede morfometribaserede tilgange i tilfælde af manglende konsistens og specificitet af farvning af objekter. - Vælg den ønskede signalskalering: Automatisk skalering eller fast skalering.
BEMÆRK: Hvis du vælger Automatisk skalering, skaleres hvert komponentplan automatisk, før objektsegmenteringen udføres. Indstillingen Fast skalering anbefales, når der kræves bedre segmenteringsydeevne, og pletsignaler er konsistente og pålidelige. - Vælg den primære komponent til objektsegmentering på rullelisten.
- Juster minimumsignalværdien for den primære komponent til den ønskede tærskelværdi.
- Hvis du automatisk vil udfylde huller i objekter, skal du vælge Fyld huller.
- Hvis du vil registrere objekter, der berører andre objekter som individuelle objekter, skal du markere afkrydsningsfeltet Afgræns opdeling i stedet for som ét objekt, når du har markeret afkrydsningsfeltet Maksimal størrelse (pixel).
- Hvis du vil udelade objekter baseret på objektets rundhed, skal du markere afkrydsningsfeltet Rundhed og angive den ønskede minimumcirkel .
- Tæl alle stromale celler (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−og DAPI+), herunder cellerne omkring blodkarrene.
- Tæl immuncellerne separat, herunder T-celler (CD3+ og DAPI+), B-celler (CD20+ og DAPI+), makrofager (CD68+ og DAPI+) og uNK-celler (CD56+ og DAPI+).
- Udtrykke data som procentdele af immuncellerne i forhold til det samlede antal stromale celler for hvert fanget billede, og rapportere det endelige celletal som et gennemsnit af alle felter.
- Brug Vis editor til at få vist de resulterende datatabeller efter behandling. Eksporter tabellen Tæl data.
- Kvantificering af rumlig fordeling af endometrieimmun celle
- Under 200x forstørrelse estimeres L-funktionen ved hjælp af R-programmet for et interval på 0-20 μm, der betragtes som en cellecellekontakts maksimale afstand14.
BEMÆRK: R-værktøjslinjen 'spatstat' blev brugt til at måle L-funktionen.- Angiver niveauet af klyngedannelse af forskellige par immunceller baseret på området under kurven (AUC) af deres L-funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den overordnede skematiske proces med at udføre en 4-farve multiplex assay til påvisning af 4 endometrie immuncelletyper er vist i figur 1. Kort sagt krævede protokollen for denne multiplex immunofluorescence farvning 8 nøgletrin: 1. Slidepræparat, 2. Epitop hentning, 3. Blokering, 4. Primær antistofapplikation, 5. Sekundær antistofapplikation, 6. Signalforstærkning, 7. Fjernelse af antistof og 8. Counterstain og mount. Billedgengivelse og -analyse blev derefter udført ved hjælp af Mantra-arbejdsstationen med det spektralbibliotek, der blev genereret ved hjælp af inForm Image Analysis-softwaren til at differentiere de 4 immuncelletyper i endometriumprøven (Figur 2).
Fire endometrie immuncelletyper kan identificeres i humane endometriumprøver ved hjælp af denne multiplex farvningsteknik: CD3+ T-celler, CD20+ B-celler, CD68+ makrofager og CD56+ uNK-celler (Figur 3). Fluorophoreinterferens skal dog nøje overvejes for at opnå et klart og brugbart billede. Selv om denne multispektrale teknologi ved hjælp af Mantra Workstation kan understøtte op til 8-plex assays, anvendelsen af de 4 fluorophores, der anvendes i denne protokol viste optimal ydeevne uden fluorophore interferens på grund af forskellene i emission spektre af fluorophores. I modsætning hertil kræver multiplex farvning, der involverer 5-8 fluorophorer, ofte mere opmærksomhed mod fluorophoreinterferens som følge af udstråling fra de delte bølgelængder.
For at overvinde denne ulempe ville monoplex farvning være nødvendig for at bestemme rækkefølgen af hvert antistof i multiplexet og identificere udtryksniveauet og mønsteret for hver immunmarkør i endometriumprøven. Dette kan bidrage til at bestemme farvning sekvens af markører og deres tilhørende TSA fluorophore parringer. Når monoplex assay er afsluttet til bestemmelse af rækkefølgen af antistoffer, der skal anvendes, det næste skridt vil være at vælge fluorophore til påvisning efter multiplex farvning. Der skal vælges et unikt fluorophore for hvert interessestof. Antallet af fluorsynd med hver fluorophore vil groft sagt være den fluorescerende bølgelængde, der udsendes under excitation (tabel 1 og tabel 2). En tilgang til forebyggelse af fluorophore interferens er at vælge fluorophor par med bølgelængder så langt fra hinanden som muligt (især for co-lokalisering antistoffer). Dette kan hjælpe med at reducere overskydende spektral overlapning og give et skarpt billede og mere pålidelig phenotyping. Desuden kan den omhyggelige evaluering ved at tænde og slukke lasere fra multiplexkompositbilledet i inForm-softwaren også hjælpe med at genkende farvningsmønstrene for at minimere fluorophor mætning (Figur 4).
Til billedanalyse kan antallet af CD3+ T-celler, CD20+ B-celler, CD68+ makrofager, CD56+ uNK-celler og stromale celler i endometrie stroma (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− og DAPI-farvede) tælles automatisk ved hjælp af inForm Tissue Finder Software 14.0 (Figur 5). Hver immuncelletypetæthed blev udtrykt som en procentdel i forhold til det samlede antal stromalceller (Figur 5). Tilsvarende var kvantificeringen af den rumlige fordeling af endometrieimmuncellerne baseret på X- og Y-positionen for hver enkelt immuncelle, der er fremstillet af InForm-systemet (figur 6). Ved hjælp af R-sproget kan niveauet af klyngedannelse af forskellige par immunceller baseret på AUC derefter skelnes.
Figur 1: Farvning af arbejdsprocesdiagram. Forkortelser: BSA = kvæg serum albumin; HRP = peberrod peroxidase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arbejdsstation til billedoptagelse og -analyse. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) uforarbejdet Spektralbillede, (C) sammensat billede, (D) vævssegmentering (epitel- og stromale rum), (E) sammensat billede af endometriumvæv, der viser fire farvede markører til at identificere forskellige cellepopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Spektral billeddannelse. Multiplex immunstaining af 4 forskellige immuncelletyper blev udført på endometriebiopsier fra (A) en frugtbar kontrol kvinde og (B) en kvinde med uforklarlige RM præsenteret som enkelt multispektral billeddannelse. Efter produktionen af et enkeltfarvet bibliotek kunne spektral blanding afsløre billeddannelse af enkelte fluorophorer, der repræsenterer (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. Et sammensat billede blev derefter skabt ved at indarbejde alle fluorophores efter multispektral billeddannelse (H). Skalastænger = 50 μm (A, B). Forkortelser: LE = luminal epitel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; RM = tilbagevendende abort. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Værktøjet Antal informe. Værktøjet inForm-softwaretællinger aktiveres ved at vælge ikonet for beigeboks (angivet med ↓). (A) Billedforberedelse, (B, C) segmentering af væv til håndtegnet træning og automatisering, (D) segmentering af individuelle celler, (E) phenotyping cellerne baseret på fluorophore intensitet, (F) analyse for fluorophor intensitet (den røde boks viser antallet af positive celler i den valgte fluorophore intensitet), og (G) eksportere resultaterne til brug (den røde boks angiver eksportmuligheder). Forkortelse: IHC = immunohistokemisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Celletælling. (A) Fænotypning af cellerne til automatisk celletælling og (B) output af de positive farvede celler i det segmenterede område (f.eks. stromal) til yderligere sammenligning og statistisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Måling af rumlig tæthed. (A) Automatisk påvisning af positionen af positivt farvede immunceller i det segmenterede område (f.eks. stromal), (B) outputvisning af koordinaten for hver positivt farvet CD20+ immuncelle og (C) bestemmelse af den rumlige tæthed og lokalisering mellem CD20+ celler og andre immunceller i de segmenterede vævsområder ved hjælp af Spatstat. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Orden | Antistof | Klon | Kloning | Antistoffortyndingsfaktor | Opaler | Opal fortyndingsfaktor |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoklonalt | 1 ud af 100 | Opal 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoklonalt | 1 ud af 100 | Opal 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoklonalt | 1 ud af 100 | Opal 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoklonalt | 1 ud af 100 | Opal 690 | 0.111111111 |
Tabel 1: Liste over anvendte antistoffer, kloner og koncentrationer.
| Farve | Excitation maksimum (nm) | Emissions maksimum (nm) | Forventet registrering i filtersæt (navn) | Forventet farve |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Blå |
| Opal 520 | 494 | 525 | FITC | Grøn |
| Opal 620 | 588 | 616 | Cy3 og Texas Red | Rav |
| Opal 650 | 627 | 650 | Texas Rød og Cy5 | Appelsin |
| Opal 690 | 676 | 694 | Texas Rød og Cy5 | Tydelig |
Tabel 2: Liste over fluorophorer med deres maksimale excitation og emission bølgelængder, forventet detektion i passende filtersæt, og observerbare farver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Det er vigtigt at bemærke, at multiplex farvning kræver omhyggelig optimering. Antigen hentning, ved hjælp af citrat buffer og mikrobølge teknologi, kræver optimering for at sikre fuldstændig antistof stripning og opretholde væv levedygtighed. Da TSA-reagenser kovalent binder sig til steder omkring antigen, kan de potentielt hæmme bindingen af et efterfølgende primært antistof gennem sterisk hindring (også kendt som "paraplyeffekten"). Dette har tendens til at forekomme, når flere immunmarkører opholder sig i et enkelt cellerum og forårsager fluorophore interferens. For at identificere, om der vil være en effekt, ville det være afgørende at udføre monoplex IHC / IF på forhånd for at identificere eventuelle overlapninger i lokaliseringen af immuncellerne. Da enkeltprøvefarvning ville være nødvendig for at generere spektralbiblioteket, kan validerede spektrebiblioteker lette forskelsbehandlingen af individuelle signaler for yderligere at forhindre fluorophorinterens. Om nødvendigt kan primære antistofkoncentrationer og inkubationstider, fluorophore-antistofparring, TSA-fluorophorekoncentrationer og farvningsrækkefølge ændres for at minimere fluorophorinterens. Ligeledes er det vigtigt at afbalancere HRP-koncentrationerne korrekt for at forhindre TSA-dimerdannelse. Dette kan opnås ved titrering af primære og sekundære antistoffer. Desuden er det af afgørende betydning at huske, at koncentrationer og inkubationstiderne for primære antistoffer, der anvendes til multiplexfarvning, kan variere fra dem, der anvendes i konventionel kromogen enkeltfarvning. Derfor bør bestemmelse af koncentrationen og rækkefølgen af antistoffer til at ansøge om multiplex farvning udføres på forhånd.
Ændringer og fejlfinding
I denne undersøgelse anvendte vi multiplex fluorescens immunohistokemisk farvning til samtidig at opdage samspillet mellem fire store immuncelletyper i endometriumbiopsier fra kvinder med og uden RM. Denne teknik bruger antistoffer mod CD3 til T-celler, CD20 til B-celler, CD68 til makrofager og CD56 til uNK-celler for at skelne mellem disse celletyper. Baseret på denne metode fandt vi, at medianen CD3+, CD68+ +og CD56+ celletæthedsværdier hos RM-kvinderne var betydeligt højere end de frugtbare kontroller15. Klyngedannelsen mellem CD56+ uNK-celler og CD68+ makrofager var betydeligt højere i RM-gruppen end i de frugtbare kontroller. Derudover afslørede brugen af denne metode, at CD56+ uNK-celler syntes at have både numerisk og rumlig korrelation med CD68+ makrofager hos begge grupper af kvinder. I modsætning hertil har CD56+ uNK-celler en signifikant numerisk, men ikke rumlig korrelation med CD3+ T-celler hos kvinder med RM15. Denne metode bestemmer også det rumlige forhold mellem flere immuncelletyper i endometriet. Positiviteten for en bestemt markør kan dog i nogle tilfælde være på grænsen. For at løse dette problem er det tilrådeligt at inkludere en positiv kontrol og en negativ kontrol for at bestemme tærsklen for positivitet ved opførelsen af spektralbiblioteket. Derudover kan den omhyggelige evaluering ved at tænde og slukke lasere fra multiplexkompositbilledet i inForm-softwaren også hjælpe med at genkende farvningsmønstrene for at minimere fluorophor mætning.
Begrænsninger af teknikken
Identifikation af fluorophore interferens under datafortolkning er afgørende for at skelne mellem ægte colocalization af markører og ublandet artefakter. Denne multiplex farvning metode udnytter TSA-baserede reagenser drevet af enzymatisk forstærkning, som kan øge antigen markør intensitet med 10-100 fold i forhold til konventionelle indirekte IF metoder. Dette skaber en risiko for overaktiv tyramiddeposition, hvilket potentielt kan resultere i en paraplyeffekt og/eller signalafblødning. For at identificere overstaining kan signalniveauer visuelt vurderes ved at blande billeder i inForm og svæve markøren over lyse, positive områder i et multipleksvævsbillede. Signalniveauerne bør normalt forblive under 30 og ideelt set inden for en faktor 3 af hinanden, især for spektralt tilstødende fluorophorer. Over 5-fold forskelle i signaler til spektralt tilstødende fluorophorer kan føre til fluorophore interferens og forårsage ublandet artefakter. Hvis signalniveauerne for fluorophor viser over 3 gange forskellen fra den tilstødende fluorophore, skal TSA's fluorophorkoncentrationer justeres for at opnå signalbalance. Når signalet er bekræftet at være inden for det korrekte interval, skal signal-til-baggrund-forholdet opretholdes ved <1:10 for at sikre, at den positive farvning ikke fejlagtigt opdages fra den uspecifikke baggrund.
Da spektral krydstale også kan skabe betydelig fluorophore interferens, rækkefølgen af farvning skal justeres til at adskille spektralt tilstødende farvestoffer i både sekvens og udtryk for markører. Selv om denne multispektrale teknologi ved hjælp af Mantra Workstation understøtter op til 8-plex assays, anvendelsen af 4 fluorophores, nemlig Opal 520, 540, 620 og 690, viser den bedste ydeevne uden fluorophore interferens. Brugen af ≥5 fluorophores kræver ofte mere optimering og validering for at undgå spektral krydstale på grund af de spektrale profiler af fluorophores, der deler proksimale bølgelængder. Med andre ord er antallet af mål, der kan påvises samtidigt ved denne tilgang, kun begrænset af antallet af bølgelængdebånd og excitations-/emissionsfiltersæt, der er til rådighed. For at udelukke potentiel overstaining af en TSA-fluorophore, der blokerer for yderligere anvendelse af andre TSA-fluorophorer og/eller for at identificere signalkrydstale, er det derfor vigtigt at være omhyggelig ved at tænde og slukke lag fra multiplexkompositbilledet i inForm-softwaren; fortolkning af farvningsmønstrene fra den enkelte IHC-farvning korrekt og leder efter åbenlyse tab, gevinst eller identiske signaler i et fly svarende til lokalisering i et andet fly.
Multispektral farvning kræver antistoffer parret med specifikke fluorophorer til samtidig at opdage for flere markører. Denne fluorophore-antistofparring følger to regler: i) fluorophorer, der er tildelt co-udtrykte markører, skal være spektralt fra hinanden, og ii) mere rigelige mål bør parres med fluorophorer med lavere lysstyrke eller omvendt. Rækkefølgen af farvning skal også arrangeres, så sekventielle antistoffer ikke co-lokalisere i de samme celle rum i de farvede celler. Ud over antistofkoncentrationerne og inkubationstiderne, som er kritiske faktorer i konventionelle farvningsmetoder, skal yderligere parametre, såsom passende fluorophore-antistofparring, TSA-fluorophorkoncentrationer, farvningssekvensen og eksponeringen af et specifikt antistof for en eller flere mikrobølgebehandlinger, derfor overvejes for vellykket multiplexfarvning. På grund af høj variation i forsøgsprøver kan en given multiplexprotokol ikke generere det samme resultat i andre typer af forsøgsprøver.
Hele Opal multiplex sekventiel farvning proces kan tage fra en til flere dage afhængigt af antallet af markører involveret i panelet og den primære antistof inkubation gange. I modsætning hertil tillader standard IF-metoder typisk visualisering af 4-5 markører i en enkelt runde farvning. Det skal bemærkes, at de betingelser, der er optimeret ved hjælp af den konventionelle IHC-metode, skal optimeres yderligere, før du fortsætter med multiplex farvningsprocedurer, som involverer yderligere, flere mikrobølgebehandlinger og anvendelsen af TSA-fluorophorer, der i sidste ende vil påvirke farvningsintensiteten af hvert antistof. I øjeblikket, billeddannelse tilgange, der udnytter multispektrale teknologier kan kræve dyre og dedikerede instrumentering. Derudover kan det kun begrænses til billedvalgte regioner af interesse. Derfor kan dette ikke være optimalt for laboratorier med begrænsede ressourcer og scouting af væv med usikre antigen mål.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
En særlig styrke ved denne nuværende metode er evnen til at måle tætheden af flere immuncelletyper i endometriet samtidigt i modsætning til konventionelle IHC-metoder, der kun kan mærke en til to celletyper i en enkelt vævssektion. Flowcytometri er en anden metode, der kan analysere de relative proportioner af forskellige immuncelletyper i endometrieprøven; Det ville dog ikke være i stand til at give geografisk information mellem forskellige immuncelletyper og den specifikke fordeling inden for forskellige endometrierum. Desuden er vævsudtømning et alvorligt problem i klinisk praksis, især under kliniske forsøg og ved brug af biopsiprøver. Disse to konventionelle metoder ville kræve et stort antal prøver (enten sektioner eller celler) til optimering af proceduren og til påvisning af flere immuncelletyper i endometriet hos kvinder med og uden RM.
Som beskrevet i denne protokol er Opal-arbejdsgangen designet til påvisning af op til syv markører i samme vævssektion ved hjælp af Mantra Workstation. Derudover er arter krydsreaktivitet under antistofvalg ikke en begrænsning af denne teknologi. Faktisk er en fordel ved denne teknologi, at den tillader brug af antistoffer opdrættet i samme art til påvisning af op til syv markører. Denne fremgangsmåde indebærer påvisning med fluorescerende TSA reagenser efterfulgt af mikrobølge behandling for at fjerne eventuelle uspecifikke farvning. Efter mikrobølgebaseret stripning kan der derefter udføres en anden runde farvning for yderligere måldetektering uden risiko for antistofkrydsreaktivitet. Derudover kan denne TSA-detektionsmetode udføres på mindst 3 dage for at kombinere op til 7 fluorochromes, mens der stadig produceres pålidelige resultater til påvisning af proteinmål med lavt udtryk. En anden fordel ved multiplex farvning over den traditionelle IHC-undersøgelse er dens forbedrede effektivitet, da målingen er automatiseret, hvilket kan eliminere subjektiv bias. De genererede kvantitative data repræsenterer analysens slutresultater.
Fremtidige ansøgninger
Rækkevidden af denne multiplex-protokol er enorm. Vigtigere er dette det første papir til at beskrive metoden til påvisning af multiplexed immunofluorescence markør udtryk ved hjælp af Mantra Arbejdsstation og billedanalyse ved hjælp af InForm 2.2.1 software til at give nøjagtige og reproducerbare resultater i differentiering flere immuncellepopulationer hos kvinder med og uden RM. Vigtigere, lokalisering af flere mål i samme væv sektion kan give unik indsigt i deres cellulære interaktioner. I sidste ende vil dette føre til en bedre forståelse af immuncellemikromiljøet under embryoimplantatering hos kvinder med RM til etablering af specifik målrettet behandling.
Desuden bidrog vores nuværende metoder til at påvise, at flere immunceller og deres interaktioner kan være vigtige for endometriets funktion. Dette fremgår af de betydelige ændringer i tætheden af tre ud af fire endometrieimmuncelletyper og en betydelig stigning i klyngedannelsen mellem CD68+ og CD56+-celler. Omvendt, de unormale interaktioner af disse immuncelletyper kan være disponerende faktorer for RM. Vigtigere, i modsætning til påvisning af en enkelt undertype af endometrie immunceller, anvendelsen af denne multiplex IHC farvning kan give en dybdegående forståelse af den immunologiske regulering af embryo implantation. Derudover kan kvantificeringen og yderligere forståelse af rumlige træk i immunmikromiljøet hjælpe med at kaste lys over biologien af denne sygdom i forbindelse med immunterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund i 2018 og Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
