Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO’s) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.
Het vermogen om de ontwikkeling van het menselijk hart in gezondheid en ziekte te bestuderen, wordt sterk beperkt door het vermogen om de complexiteit van het menselijk hart in vitro te modelleren. Het ontwikkelen van efficiëntere orgaanachtige platforms die complexe in vivo fenotypen kunnen modelleren, zoals organoïden en organen-op-een-chip, zal het vermogen om de ontwikkeling en ziekte van het menselijk hart te bestuderen verbeteren. Dit artikel beschrijft een protocol om zeer complexe menselijke hartorganoïden (hHO’s) te genereren door zelforganisatie met behulp van menselijke pluripotente stamcellen en stapsgewijze ontwikkelingswegactivering met behulp van kleine molecuulremmers. Embryoïde lichamen (EB’s) worden gegenereerd in een 96-well plaat met ronde bodem, ultra-lage bevestigingsputten, waardoor de suspensiecultuur van geïndividualiseerde constructies wordt vergemakkelijkt.
De EB’s ondergaan differentiatie in hHO’s door een driestaps Wnt-signaleringsmodulatiestrategie, die een initiële Wnt-routeactivering omvat om het lot van het cardiale mesoderm te induceren, een tweede stap van Wnt-remming om definitieve cardiale afstammingslijnen te creëren en een derde Wnt-activeringsstap om pro-epicardiale orgaanweefsels te induceren. Deze stappen, uitgevoerd in een 96-well formaat, zijn zeer efficiënt, reproduceerbaar en produceren grote hoeveelheden organoïden per run. Analyse door immunofluorescentie beeldvorming van dag 3 tot dag 11 van differentiatie onthult eerste en tweede hartveldspecificaties en zeer complexe weefsels in hHO’s op dag 15, inclusief myocardiaal weefsel met regio’s van atriale en ventriculaire cardiomyocyten, evenals interne kamers bekleed met endocardiaal weefsel. De organoïden vertonen ook een ingewikkeld vasculair netwerk door de hele structuur en een externe bekleding van epicardiaal weefsel. Vanuit functioneel oogpunt kloppen hHO’s robuust en vertonen ze een normale calciumactiviteit zoals bepaald door Fluo-4 live imaging. Over het algemeen vormt dit protocol een solide platform voor in vitro studies in menselijke orgaanachtige hartweefsels.
Aangeboren hartafwijkingen (CHD’s) zijn het meest voorkomende type aangeboren afwijking bij de mens en treffen ongeveer 1% van alle levendgeborenen1,2,3. Onder de meeste omstandigheden blijven de redenen voor CHD’s onbekend. Het vermogen om menselijke hartmodellen in het laboratorium te maken die sterk lijken op het zich ontwikkelende menselijke hart, vormt een belangrijke stap voorwaarts om de onderliggende oorzaken van CHD’s bij mensen rechtstreeks te bestuderen in plaats van in surrogaatdiermodellen.
De belichaming van in het laboratorium gekweekte weefselmodellen zijn organoïden, 3D-celconstructies die lijken op een orgaan dat van belang is voor de celsamenstelling en fysiologische functie. Organoïden zijn vaak afgeleid van stamcellen of voorlopercellen en zijn met succes gebruikt om vele organen te modelleren, zoals de hersenen4,5, nier6,7, darm8,9, long10,11, lever12,13 en pancreas14,15 , om er maar een paar te noemen. Recente studies zijn naar voren gekomen die de haalbaarheid aantonen van het creëren van zelfassemblerende hartorganoïden om de hartontwikkeling in vitro te bestuderen. Deze modellen omvatten het gebruik van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) om vroege hartontwikkeling te modelleren16,17 tot atrioventriculaire specificatie18 en menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) om multi-kiemlaag cardiale endoderm organoïden19 en gekamerde cardioïden20 met zeer complexe cellulaire samenstelling te genereren.
Dit artikel presenteert een nieuw 3-staps WNT-modulatieprotocol om zeer complexe hHO’s op een efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren. Organoïden worden gegenereerd in 96-well platen, wat resulteert in een schaalbaar, high-throughput systeem dat eenvoudig kan worden geautomatiseerd. Deze methode is gebaseerd op het creëren van hPSC-aggregaten en het activeren van ontwikkelingsstappen van cardiogenese, waaronder mesoderm- en cardiale mesodermvorming, eerste en tweede hartveldspecificatie, pro-epicardiale orgaanvorming en atrioventriculaire specificatie. Na 15 dagen differentiatie bevatten hHO’s alle belangrijke cellijnen in het hart, goed gedefinieerde interne kamers, atriale en ventriculaire kamers en een vasculair netwerk in de organoïde. Dit zeer geavanceerde en reproduceerbare hartorganoïde systeem is vatbaar voor het onderzoeken van structurele, functionele, moleculaire en transcriptomische analyses in de studie van hartontwikkeling en ziekten en farmacologische screening.
Recente ontwikkelingen in van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten en andere cellen van cardiale oorsprong zijn gebruikt om de ontwikkeling van het menselijk hart22,24,25 en ziekte26,27,28 te modelleren en als hulpmiddelen om therapeutica29,30 en toxische agentia <sup…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder de awardnummers K01HL135464 en R01HL151505 en door de American Heart Association onder awardnummer 19IPLOI34660342. We willen de MSU Advanced Microscopy Core en Dr. William Jackson van de MSU Department of Pharmacology and Toxicology bedanken voor toegang tot confocale microscopen, de IQ Microscopy Core en de MSU Genomics Core voor sequencingdiensten. We willen ook alle leden van het Aguirre Lab bedanken voor hun waardevolle opmerkingen en advies.
Antibodies | |||
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
Media and Reagents | |||
Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
기타 | |||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
ImageJ | NIH | Image processing software | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |