Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi
Summary
Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO’lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.
Abstract
Sağlık ve hastalıkta insan kardiyak gelişimini inceleme yeteneği, insan kalbinin in vitro karmaşıklığını modelleme kapasitesi ile oldukça sınırlıdır. Organoidler ve çip üzerindeki organlar gibi karmaşık in vivo fenotipleri modelleyebilen daha verimli organ benzeri platformlar geliştirmek, insan kalbi gelişimini ve hastalığını inceleme yeteneğini artıracaktır. Bu makalede, insan pluripotent kök hücreleri ve küçük molekül inhibitörleri kullanılarak adım adım gelişimsel yol aktivasyonu kullanılarak kendi kendine örgütlenerek son derece karmaşık insan kalbi organoidleri (hMO’lar) oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Embriyoid cisimler (EBs), 96 kuyulu bir plakada yuvarlak tabanlı, ultra düşük bağlantı kuyuları ile üretilir ve bireyselleştirilmiş yapıların süspansiyon kültürünü kolaylaştırır.
EB’ler, kardiyak mezoderm kaderini teşvik etmek için ilk Wnt yolu aktivasyonunu, kesin kardiyak soylar oluşturmak için Wnt inhibisyonunun ikinci bir adımını ve proepikardiyal organ dokularını indükleyen üçüncü bir Wnt aktivasyon adımını içeren üç adımlı bir Wnt sinyal modülasyon stratejisi ile hMO’lara farklılaşmaya tabir edilir. 96 kuyu formatında gerçekleştirilen bu adımlar son derece verimli, tekrarlanabilir ve çalışma başına büyük miktarlarda organoid üretir. Farklılaşmanın 3. gününden 11. gününe kadar immünofluoresans görüntüleme ile yapılan analizler, atriyal ve ventrikül kardiyomiyosit bölgelerine sahip miyokard dokusunun yanı sıra endokardiyal doku ile kaplı iç odalar da dahil olmak üzere, 15. günde hMO’ların içindeki birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonlarını ve son derece karmaşık dokuları ortaya koymaktadır. Organoidler ayrıca yapı boyunca karmaşık bir damar ağı ve epikardial dokunun dış astarını sergiler. Fonksiyonel açıdan, hMO’lar sağlam bir şekilde döver ve Fluo-4 canlı görüntüleme ile belirlenen normal kalsiyum aktivitesini sunar. Genel olarak, bu protokol insan organı benzeri kalp dokularında in vitro çalışmalar için sağlam bir platform oluşturmaktadır.
Introduction
Konjenital kalp defektleri (CHD) insanlarda en sık görülen konjenital defekt türüdür ve tüm canlı doğumların yaklaşık % 1’ini etkiler1,2,3. Çoğu durumda, CHD’lerin nedenleri bilinmemektedir. Laboratuvarda gelişmekte olan insan kalbine çok benzeyen insan kalbi modelleri oluşturma yeteneği, vekil hayvan modellerinden ziyade insanlarda CHD’lerin altında kalan nedenleri doğrudan incelemek için önemli bir adım oluşturmaktadır.
Laboratuvarda yetiştirilen doku modellerinin özeti organoidlerdir, hücre kompozisyonuna ve fizyolojik işleve ilgi gösteren bir organa benzeyen 3D hücre yapılarıdır. Organoidler genellikle kök hücrelerden veya progenitör hücrelerden türetilir ve beyin4,5, böbrek6,7, bağırsak8,9, akciğer10,11, karaciğer12,13 ve pankreas14,15 gibi birçok organı modellemek için başarıyla kullanılmıştır. , sadece birkaç isim vermek için. Son çalışmalar, kalp gelişimini in vitro olarak incelemek için kendi kendine bir araya getiren kalp organoidleri oluşturmanın fizibilitesini göstermiştir. Bu modeller, erken kalp gelişimini modellemek için fare embriyonik kök hücrelerini (mESC’ ler) kullanmayı içerir16,17 atriyoventriküler spesifikasyon18’e kadar ve insan pluripotent kök hücreleri (hPSC’ ler) çok mikrop tabakası kardiyak-endoderm organoidleri19 ve son derece karmaşık hücresel bileşime sahip odalı kardiyooidler20 üretmek için.
Bu makale, son derece karmaşık hMO’ları verimli ve uygun maliyetli bir şekilde oluşturmak için yeni bir 3 adımlı WNT modülasyon protokolü sunun. Organoidler 96 kuyulu plakalarda üretilir, bu da kolayca otomatikleştirilebilir ölçeklenebilir, yüksek verimli bir sistemle sonuçlanır. Bu yöntem, hPSC agregalarının oluşturulmasına ve mezoderm ve kardiyak mezoderm oluşumu, birinci ve ikinci kalp alanı spesifikasyonu, proepikardiyal organ oluşumu ve atriyoventriküler spesifikasyon dahil olmak üzere kardiyogenez gelişim adımlarını tetiklemeye dayanır. 15 günlük farklılaşmadan sonra, hNO’lar kalpte bulunan tüm ana hücre soylarını, iyi tanımlanmış iç odaları, atriyal ve ventrikül odalarını ve organoid boyunca bir damar ağını içerir. Bu son derece sofistike ve tekrarlanabilir kalp organoid sistemi, kalp gelişimi, hastalıkları ve farmakolojik tarama çalışmalarında yapısal, fonksiyonel, moleküler ve transkriptomik analizleri araştırmaya açıktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan kök hücre türevli kardiyomiyositler ve kardiyak kökenli diğer hücrelerdeki son gelişmeler, insan kalbi gelişimini modellemek için 22,24,25 ve hastalık26,27,28 ve terapötikleri taramak için araçlar olarak kullanılmıştır29,30 ve toksik aj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından K01HL135464 ve R01HL151505 ödül numaraları altında ve Amerikan Kalp Derneği tarafından 19IPLOI34660342 ödül numarası altında desteklendi. MSU Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü’nden MSU Advanced Microscopy Core ve Dr. William Jackson’a konfokal mikroskoplara erişim için, IQ Mikroskopi Çekirdeğine ve MSU Genomik Çekirdeği’ne sıralama hizmetleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Aguirre Lab’in tüm üyelerine değerli yorumları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| 기타 | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. 의학. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
