Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Herstellung entwicklungsrelevanter menschlicher Herzorganoide (hHOs) unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen durch Selbstorganisation. Das Protokoll beruht auf der sequentiellen Aktivierung von Entwicklungshinweisen und produziert hochkomplexes, funktionell relevantes menschliches Herzgewebe.
Abstract
Die Fähigkeit, die menschliche Herzentwicklung in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen, ist durch die Fähigkeit, die Komplexität des menschlichen Herzens in vitro zu modellieren, stark eingeschränkt. Die Entwicklung effizienterer organähnlicher Plattformen, die komplexe In-vivo-Phänotypen wie Organoide und Organe auf einem Chip modellieren können, wird die Fähigkeit verbessern, die Entwicklung und Erkrankung des menschlichen Herzens zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung hochkomplexer menschlicher Herzorganoide (hHOs) durch Selbstorganisation unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen und schrittweise Aktivierung des Entwicklungsweges unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren. Embryoide Körper (EBs) werden in einer 96-Well-Platte mit runden, extrem niedrigen Befestigungstöpfen erzeugt, was die Suspensionskultur individualisierter Konstrukte erleichtert.
Die EBs werden durch eine dreistufige Wnt-Signalmodulationsstrategie in hHOs differenziert, die eine anfängliche Wnt-Signalwegaktivierung zur Induktion des kardialen Mesodermenschicksals, einen zweiten Schritt der Wnt-Hemmung zur Schaffung definitiver Herzlinien und einen dritten Wnt-Aktivierungsschritt zur Induktion von Proepikardorgangewebe beinhaltet. Diese Schritte, die in einem 96-Well-Format durchgeführt werden, sind hocheffizient, reproduzierbar und produzieren große Mengen an Organoiden pro Lauf. Die Analyse mittels Immunfluoreszenzbildgebung von Tag 3 bis Tag 11 der Differenzierung zeigt erste und zweite Herzfeldspezifikationen und hochkomplexe Gewebe in hHOs an Tag 15, einschließlich Myokardgewebe mit Regionen von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten sowie interne Kammern, die mit Endokardgewebe ausgekleidet sind. Die Organoide weisen auch ein kompliziertes vaskuläres Netzwerk in der gesamten Struktur und eine äußere Auskleidung des epikarden Gewebes auf. Aus funktioneller Sicht schlagen hHOs robust und weisen eine normale Kalziumaktivität auf, wie sie durch Fluo-4-Live-Imaging bestimmt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll eine solide Plattform für In-vitro-Studien in menschlichen organähnlichen Herzgeweben dar.
Introduction
Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigste Art von angeborenen Defekten beim Menschen und betreffen etwa 1% aller Lebendgeburten1,2,3. Unter den meisten Umständen bleiben die Gründe für KHK unbekannt. Die Fähigkeit, menschliche Herzmodelle im Labor zu erstellen, die dem sich entwickelnden menschlichen Herzen sehr ähnlich sind, stellt einen bedeutenden Schritt nach vorne dar, um die zugrunde liegenden Ursachen von KHK beim Menschen und nicht in Leihtiermodellen direkt zu untersuchen.
Der Inbegriff von im Labor gezüchteten Gewebemodellen sind Organoide, 3D-Zellkonstrukte, die einem Organ ähneln, das für die Zellzusammensetzung und physiologische Funktion von Interesse ist. Organoide werden oft aus Stammzellen oder Vorläuferzellen gewonnen und wurden erfolgreich verwendet, um viele Organe wie Gehirn4,5, Niere6,7, Darm8,9, Lunge10,11, Leber12,13 und Bauchspeicheldrüse zu modellieren14,15 , um nur einige zu nennen. Jüngste Studien haben die Machbarkeit der Herstellung von selbstorganisierenden Herzorganoiden zur Untersuchung der Herzentwicklung in vitro gezeigt. Diese Modelle umfassen die Verwendung von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) zur Modellierung der frühen Herzentwicklung16,17 bis zur atrioventrikulären Spezifikation18 und humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) zur Erzeugung von Multikeimschicht-Herz-Endoderm-Organoiden19 und Kammernnieren20 mit hochkomplexer zellulärer Zusammensetzung.
Dieser Beitrag stellt ein neuartiges 3-stufiges WNT-Modulationsprotokoll vor, um hochkomplexe hHOs effizient und kostengünstig zu erzeugen. Organoide werden in 96-Well-Platten erzeugt, was zu einem skalierbaren Hochdurchsatzsystem führt, das leicht automatisiert werden kann. Diese Methode beruht auf der Erstellung von hPSC-Aggregaten und der Auslösung von Entwicklungsschritten der Kardiogenese, einschließlich der Mesoderm- und Herzmesodermbildung, der ersten und zweiten Herzfeldspezifikation, der Proepikardorganbildung und der atrioventrikulären Spezifikation. Nach 15 Tagen der Differenzierung enthalten hHOs alle wichtigen Zelllinien im Herzen, gut definierte innere Kammern, vorhofische und ventrikuläre Kammern und ein vaskuläres Netzwerk im gesamten Organoid. Dieses hochentwickelte und reproduzierbare Herzorganoidsystem ist für die Untersuchung struktureller, funktioneller, molekularer und transkriptomischer Analysen bei der Untersuchung der Herzentwicklung und von Krankheiten sowie des pharmakologischen Screenings geeignet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jüngste Fortschritte bei aus menschlichen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten und anderen Zellen kardialen Ursprungs wurden verwendet, um die menschliche Herzentwicklung zu modellieren22,24,25 und Krankheit26,27,28 und als Werkzeuge zum Screening von Therapeutika29,30 und tox…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute der National Institutes of Health unter den Award-Nummern K01HL135464 und R01HL151505 und von der American Heart Association unter der Award-Nummer 19IPLOI34660342 unterstützt. Wir danken dem MSU Advanced Microscopy Core und Dr. William Jackson von der MSU Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie für den Zugang zu konfokalen Mikroskopen, dem IQ Microscopy Core und dem MSU Genomics Core für Sequenzierungsdienste. Wir möchten uns auch bei allen Mitgliedern des Aguirre Lab für ihre wertvollen Kommentare und Ratschläge bedanken.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| 기타 | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. 의학. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
