Здесь мы описываем протокол для создания органоидов сердца человека (hHO), имеющих отношение к развитию, эффективно используя плюрипотентные стволовые клетки человека путем самоорганизации. Протокол опирается на последовательную активацию сигналов развития и производит очень сложные, функционально значимые ткани сердца человека.
Способность изучать развитие сердца человека в области здоровья и болезней сильно ограничена способностью моделировать сложность человеческого сердца in vitro. Разработка более эффективных органоподобных платформ, которые могут моделировать сложные фенотипы in vivo , такие как органоиды и органы на чипе, повысит способность изучать развитие сердца и болезни человека. В этой статье описывается протокол генерации очень сложных органоидов сердца человека (hHO) путем самоорганизации с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и ступенчатой активации путей развития с использованием ингибиторов малых молекул. Эмбриоидные тела (ЭБ) генерируются в 96-луночной пластине с круглодонными, сверхнизкими прикрепленными колодцами, что облегчает культуру суспензии индивидуализированных конструкций.
ЭБ подвергаются дифференцировке в hHO с помощью трехступенчатой стратегии модуляции сигналов Wnt, которая включает в себя начальную активацию пути Wnt, чтобы вызвать судьбу сердечной мезодермы, второй шаг ингибирования Wnt для создания окончательных сердечных линий и третий шаг активации Wnt для индуцирования тканей проэпикардиальных органов. Эти этапы, выполненные в формате 96 лунок, являются высокоэффективными, воспроизводимыми и производят большое количество органоидов за прогон. Анализ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации с 3 по 11 день дифференцировки выявляет особенности первого и второго полей сердца и очень сложные ткани внутри hHO на 15-й день, включая ткань миокарда с областями предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также внутренние камеры, выстланные тканью эндокарда. Органоиды также демонстрируют сложную сосудистую сеть по всей структуре и внешнюю оболочку эпикардиальной ткани. С функциональной точки зрения hHO уверенно бьются и представляют нормальную активность кальция, как определено с помощью живой визуализации Fluo-4. В целом, этот протокол представляет собой прочную платформу для исследований in vitro в органоподобных сердечных тканях человека.
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и затрагивают примерно 1% всех живорождений1,2,3. В большинстве случаев причины ИБС остаются неизвестными. Способность создавать модели человеческого сердца в лаборатории, которые очень похожи на развивающееся человеческое сердце, представляет собой значительный шаг вперед для непосредственного изучения основных причин ИБС у людей, а не у суррогатных животных моделей.
Воплощением лабораторно выращенных моделей тканей являются органоиды, 3D-клеточные конструкции, которые напоминают орган, представляющий интерес по клеточному составу и физиологической функции. Органоиды часто получают из стволовых клеток или клеток-предшественников и успешно используются для моделирования многих органов, таких как мозг4,5, почки6,7, кишечник8,9, легкие10,11, печень12,13 и поджелудочная железа14,15 , и это лишь некоторые из них. Появились недавние исследования, демонстрирующие целесообразность создания самособирающихся сердечных органоидов для изучения развития сердца in vitro. Эти модели включают использование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs) для моделирования раннего развития сердца16,17 до атриовентрикулярной спецификации18 и плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) для генерации органоидов сердечно-эндодермы с несколькими зародышевыми слоями19 и камерных кардиоидов20 с очень сложным клеточным составом.
В этой статье представлен новый 3-ступенчатый протокол модуляции WNT для создания очень сложных hHO эффективным и экономичным способом. Органоиды генерируются в 96-луночных пластинах, что приводит к масштабируемой, высокопроизводительной системе, которая может быть легко автоматизирована. Этот метод основан на создании агрегатов hPSC и запуске этапов развития кардиогенеза, включая формирование мезодермы и сердечной мезодермы, спецификацию первого и второго поля сердца, формирование проэпикардиальных органов и атриовентрикулярную спецификацию. После 15 дней дифференцировки hHO содержат все основные клеточные линии, обнаруженные в сердце, четко определенные внутренние камеры, предсердные и желудочковые камеры и сосудистую сеть по всему органоиду. Эта очень сложная и воспроизводимая органоидная система сердца поддается исследованию структурных, функциональных, молекулярных и транскриптомных анализов при изучении развития сердца, заболеваний и фармакологического скрининга.
Последние достижения в области кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека, и других клеток сердечного происхождения были использованы для моделирования развития сердца человека22,24,25 и болезней26,27,28 и в качестве инструме?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номерами K01HL135464 и R01HL151505 и Американской кардиологической ассоциацией под номером 19IPLOI34660342. Мы хотим поблагодарить MSU Advanced Microscopy Core и доктора Уильяма Джексона на кафедре фармакологии и токсикологии МГУ за доступ к конфокальным микроскопам, IQ Microscopy Core и MSU Genomics Core за услуги секвенирования. Мы также хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Агирре за их ценные замечания и советы.
Antibodies | |||
Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
Media and Reagents | |||
Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
기타 | |||
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
ImageJ | NIH | Image processing software | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |