Génération d’organoïdes cardiaques humains auto-assemblés dérivés de cellules souches pluripotentes
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour créer des organoïdes cardiaques humains (hHO) pertinents pour le développement en utilisant efficacement des cellules souches pluripotentes humaines par auto-organisation. Le protocole repose sur l’activation séquentielle des signaux de développement et produit des tissus cardiaques humains très complexes et fonctionnellement pertinents.
Abstract
La capacité d’étudier le développement cardiaque humain dans la santé et la maladie est fortement limitée par la capacité de modéliser la complexité du cœur humain in vitro. Le développement de plateformes plus efficaces semblables à des organes capables de modéliser des phénotypes in vivo complexes, tels que des organoïdes et des organes sur puce, améliorera la capacité d’étudier le développement cardiaque humain et les maladies. Cet article décrit un protocole pour générer des organoïdes cardiaques humains (hHO) très complexes par auto-organisation à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines et activation progressive de la voie de développement à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules. Les corps embryoïdes (EB) sont générés dans une plaque de 96 puits avec des puits à fond rond et à fixation ultra-basse, facilitant la culture en suspension de constructions individualisées.
Les EB subissent une différenciation en hHO par une stratégie de modulation de signalisation Wnt en trois étapes, qui implique une activation initiale de la voie Wnt pour induire le destin du mésoderme cardiaque, une deuxième étape d’inhibition Wnt pour créer des lignées cardiaques définitives et une troisième étape d’activation Wnt pour induire des tissus d’organes proépicardiques. Ces étapes, réalisées dans un format de 96 puits, sont très efficaces, reproductibles et produisent de grandes quantités d’organoïdes par course. L’analyse par imagerie par immunofluorescence du jour 3 au jour 11 de la différenciation révèle les première et deuxième spécifications du champ cardiaque et les tissus très complexes à l’intérieur des hHO au jour 15, y compris le tissu myocardique avec des régions de cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires, ainsi que des chambres internes tapissées de tissu endocardique. Les organoïdes présentent également un réseau vasculaire complexe dans toute la structure et une paroi externe du tissu épicardique. D’un point de vue fonctionnel, les hHO battent de manière robuste et présentent une activité calcique normale déterminée par l’imagerie en direct Fluo-4. Dans l’ensemble, ce protocole constitue une plate-forme solide pour les études in vitro dans les tissus cardiaques humains ressemblant à des organes.
Introduction
Les malformations cardiaques congénitales (CHD) sont le type de malformation congénitale le plus courant chez l’homme et affectent environ 1% de toutes les naissances vivantes1,2,3. Dans la plupart des cas, les raisons des maladies coronariennes demeurent inconnues. La capacité de créer des modèles cardiaques humains en laboratoire qui ressemblent étroitement au cœur humain en développement constitue un pas en avant important pour étudier directement les causes sous-jacentes des maladies coronariennes chez l’homme plutôt que dans des modèles animaux de substitution.
La quintessence des modèles tissulaires cultivés en laboratoire sont les organoïdes, des constructions cellulaires 3D qui ressemblent à un organe d’intérêt pour la composition cellulaire et la fonction physiologique. Les organoïdes sont souvent dérivés de cellules souches ou de cellules progénitrices et ont été utilisés avec succès pour modéliser de nombreux organes tels que le cerveau4,5, le rein6,7, l’intestin8,9, le poumon10,11, le foie12,13 et le pancréas14,15 , pour n’en nommer que quelques-uns. Des études récentes ont émergé démontrant la faisabilité de créer des organoïdes cardiaques auto-assemblés pour étudier le développement cardiaque in vitro. Ces modèles comprennent l’utilisation de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris pour modéliser le développement cardiaque précoce16,17 jusqu’à la spécification auriculo-ventriculaire18 et de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) pour générer des organoïdes cardio-endodermiques multi-germinaux19 et des cardioïdes chambrés20 avec une composition cellulaire très complexe.
Cet article présente un nouveau protocole de modulation WNT en 3 étapes pour générer des hHO très complexes de manière efficace et rentable. Les organoïdes sont générés dans des plaques de 96 puits, ce qui donne un système évolutif à haut débit qui peut être facilement automatisé. Cette méthode repose sur la création d’agrégats hPSC et le déclenchement des étapes de développement de la cardiogenèse, y compris la formation du mésoderme et du mésoderme cardiaque, la spécification du premier et du deuxième champ cardiaque, la formation d’organes proépicardiques et la spécification auriculo-ventriculaire. Après 15 jours de différenciation, les hHO contiennent toutes les principales lignées cellulaires présentes dans le cœur, des chambres internes bien définies, des chambres auriculaires et ventriculaires et un réseau vasculaire dans tout l’organoïde. Ce système organoïde cardiaque hautement sophistiqué et reproductible se prête à l’étude d’analyses structurelles, fonctionnelles, moléculaires et transcriptomiques dans l’étude du développement cardiaque, des maladies et du dépistage pharmacologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès récents dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines et d’autres cellules d’origine cardiaque ont été utilisés pour modéliser le développement cardiaque humain22,24,25 et la maladie26,27,28 et comme outils pour dépister les agents thérapeutiques29,30<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous les numéros de prix K01HL135464 et R01HL151505 et par l’American Heart Association sous le numéro de prix 19IPLOI34660342. Nous tenons à remercier le noyau de microscopie avancée de MSU et le Dr William Jackson du département de pharmacologie et de toxicologie de MSU pour l’accès aux microscopes confocaux, au noyau de microscopie IQ et au noyau de génomique MSU pour les services de séquençage. Nous tenons également à remercier tous les membres du Laboratoire Aguirre pour leurs précieux commentaires et conseils.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| 기타 | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
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