Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes
Summary
Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.
Abstract
La capacidad de estudiar el desarrollo cardíaco humano en la salud y la enfermedad está muy limitada por la capacidad de modelar la complejidad del corazón humano in vitro. El desarrollo de plataformas similares a órganos más eficientes que puedan modelar fenotipos complejos in vivo , como organoides y órganos en un chip, mejorará la capacidad de estudiar el desarrollo y la enfermedad del corazón humano. Este artículo describe un protocolo para generar organoides cardíacos humanos (hHO) altamente complejos mediante la autoorganización utilizando células madre pluripotentes humanas y la activación gradual de la vía de desarrollo utilizando inhibidores de moléculas pequeñas. Los cuerpos embrionarios (EB) se generan en una placa de 96 pocillos con pocillos de fijación ultra bajos de fondo redondo, lo que facilita el cultivo en suspensión de construcciones individualizadas.
Los EB se diferencian en hHO mediante una estrategia de modulación de señalización Wnt de tres pasos, que implica una activación inicial de la vía Wnt para inducir el destino del mesodermo cardíaco, un segundo paso de inhibición Wnt para crear linajes cardíacos definitivos y un tercer paso de activación Wnt para inducir tejidos de órganos proepicárdicos. Estos pasos, llevados a cabo en un formato de 96 pocillos, son altamente eficientes, reproducibles y producen grandes cantidades de organoides por tirada. El análisis por imágenes de inmunofluorescencia del día 3 al día 11 de la diferenciación revela especificaciones del primer y segundo campo cardíaco y tejidos altamente complejos dentro de hHOs en el día 15, incluido el tejido miocárdico con regiones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como cámaras internas revestidas con tejido endocárdico. Los organoides también exhiben una intrincada red vascular en toda la estructura y un revestimiento externo de tejido epicárdico. Desde un punto de vista funcional, los hHO superan con fuerza y presentan una actividad normal del calcio según lo determinado por las imágenes en vivo de Fluo-4. En general, este protocolo constituye una plataforma sólida para estudios in vitro en tejidos cardíacos similares a órganos humanos.
Introduction
Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos y afectan aproximadamente al 1% de todos los nacidos vivos1,2,3. En la mayoría de las circunstancias, las razones de los CHD siguen siendo desconocidas. La capacidad de crear modelos de corazón humano en el laboratorio que se asemejan mucho al corazón humano en desarrollo constituye un importante paso adelante para estudiar directamente las causas subyacentes de las enfermedades coronarias en humanos en lugar de en modelos animales sustitutos.
El epítome de los modelos de tejido cultivados en laboratorio son organoides, construcciones de células 3D que se asemejan a un órgano de interés en la composición celular y la función fisiológica. Los organoides a menudo se derivan de células madre o células progenitoras y se han utilizado con éxito para modelar muchos órganos como el cerebro4,5, el riñón6,7, el intestino8,9, el pulmón10,11, el hígado12,13 y el páncreas14,15 , solo por nombrar algunos. Han surgido estudios recientes que demuestran la viabilidad de crear organoides cardíacos autoensamblables para estudiar el desarrollo del corazón in vitro. Estos modelos incluyen el uso de células madre embrionarias de ratón (mESCs) para modelar el desarrollo cardíaco temprano16,17 hasta la especificación auriculoventricular18 y células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para generar organoides cardíaco-endodermo de capa multigermes19 y cardioides con cámara20 con composición celular altamente compleja.
Este artículo presenta un novedoso protocolo de modulación WNT de 3 pasos para generar hHO altamente complejos de una manera eficiente y rentable. Los organoides se generan en placas de 96 pocillos, lo que resulta en un sistema escalable y de alto rendimiento que se puede automatizar fácilmente. Este método se basa en la creación de agregados de hPSC y desencadena los pasos de desarrollo de la cardiogénesis, incluida la formación de mesodermo y mesodermo cardíaco, la especificación del primer y segundo campo cardíaco, la formación de órganos proepicárdicos y la especificación auriculoventricular. Después de 15 días de diferenciación, los hHO contienen todos los linajes celulares principales que se encuentran en el corazón, cámaras internas bien definidas, cámaras auriculares y ventriculares, y una red vascular en todo el organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado y reproducible es susceptible de investigar análisis estructurales, funcionales, moleculares y transcriptómicos en el estudio del desarrollo cardíaco y las enfermedades, y la detección farmacológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los recientes avances en cardiomiocitos derivados de células madre humanas y otras células de origen cardíaco se han utilizado para modelar el desarrollo del corazón humano22,24,25 y la enfermedad26,27,28 y como herramientas para detectar terapias29,30 y agentes <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio K01HL135464 y R01HL151505 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342. Deseamos agradecer al Núcleo de Microscopía Avanzada de MSU y al Dr. William Jackson en el Departamento de Farmacología y Toxicología de MSU por el acceso a microscopios confocales, el Núcleo de Microscopía IQ y el Núcleo de Genómica MSU por los servicios de secuenciación. También queremos agradecer a todos los miembros del Laboratorio Aguirre por sus valiosos comentarios y consejos.
Materials
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| 기타 | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13-687-711PM | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
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