Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur
Summary
Ce protocole décrit la dynamique des infections virales à l’aide du (r)SARS-CoV-2 recombinant exprimant la luciférase et la fluorescence et d’un système d’imagerie in vivo (IVIS) chez des souris transgéniques K18 hACE2 pour surmonter le besoin d’approches secondaires nécessaires pour étudier les infections par le SRAS-CoV-2 in vivo.
Abstract
La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). À ce jour, le SRAS-CoV-2 a été responsable de plus de 242 millions d’infections et de plus de 4,9 millions de décès dans le monde. Comme d’autres virus, l’étude du SRAS-CoV-2 nécessite l’utilisation de méthodes expérimentales pour détecter la présence de virus dans les cellules infectées et/ou dans des modèles animaux. Pour surmonter cette limitation, nous avons généré des protéines recombinantes (r)SARS-CoV-2 capables de réplication qui expriment des protéines bioluminescentes (nanoluciférase, Nluc) ou fluorescentes (Vénus). Ces rSARS-CoV-2 exprimant le rapporteur permettent de suivre les infections virales in vitro et in vivo sur la base de l’expression des gènes rapporteurs Nluc et Venus. Ici, l’étude décrit l’utilisation de rSARS-CoV-2 / Nluc et rSARS-CoV-2 / Venus pour détecter et suivre l’infection par le SRAS-CoV-2 dans le modèle murin transgénique de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine K18 (hACE2) précédemment décrit à l’aide de systèmes d’imagerie in vivo (IVIS). Ce rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus montrent une pathogénicité de type rSARS-CoV-2/WT et une réplication virale in vivo. Il est important de noter que Nluc et l’expression de Vénus nous permettent de suivre directement les infections virales in vivo et ex vivo, chez des souris infectées. Ces rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus représentent une excellente option pour étudier la biologie du SARS-CoV-2 in vivo, pour comprendre l’infection virale et la maladie COVID-19 associée, et pour identifier des traitements prophylactiques et/ou thérapeutiques efficaces pour lutter contre l’infection par le SARS-CoV-2.
Introduction
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est un virus à ARN simple brin enveloppé, à sens positif, qui appartient à la lignée des Betacoronavirus de la famille des Coronaviridae 1. Cette famille virale est divisée en Alpha-, Beta-, Gamma-, et Delta-coronavirus1. Les alpha- et betacoronavirus infectent principalement les mammifères, tandis que les Gamma- et Deltacoronavirus infectent presque exclusivement les oiseaux2. À ce jour, sept coronavirus (CoV) ont franchi les barrières des espèces et sont apparus comme des coronavirus humains (HCoV) : deux alpha-CoV (HCoV-229E et HCoV-NL63) et cinq bêta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient [MERS-CoV] et SARS-CoV-2)3,4,5,6. Le SRAS-CoV, le MERS-CoV et le SARS-CoV-2 sont hautement pathogènes et causent une infection grave des voies respiratoires inférieures7. Avant l’émergence du SRAS-CoV-2, il y avait deux épidémies causées par des CoV : le SARS-CoV à Guangdong Providence, en Chine, de 2002 à 2003, avec un taux de létalité d’environ 9,7 %; et merS-CoV au Moyen-Orient de 2012 à aujourd’hui, avec un CFR d’environ 34%7,8. Le SARS-CoV-2 a un CFR global compris entre 3,4% et 49%, les conditions sous-jacentes contribuant à un CFR plus élevéde 8,9. Depuis sa découverte en décembre 2019, à Wuhan, en Chine, le SARS-CoV-2 a été responsable de plus de 242 millions d’infections humaines et de plus de 4,9 millions de décès humains dans le monde 7,10,11,12. Notamment, depuis la fin de 2020, les nouvelles variantes préoccupantes (VoC) et les variantes d’intérêt (VoI) du SRAS-CoV-2 ont eu une incidence sur les caractéristiques du virus, y compris la transmission et l’antigénicité 9,13, et l’orientation générale de la pandémie de COVID-19. Pour le traitement des infections à SARS-CoV-2, il n’existe actuellement qu’un seul États-Unis (États-Unis). L’antiviral thérapeutique (remdésivir) de la Food and Drug Administration (FDA) et un médicament d’autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) (baricitinib, à administrer en association avec le remdésivir)14. Il existe également 6 anticorps monoclonaux EUA approuvés: REGEN-COV (casirivimab et imdevimab, administrés ensemble), sotrovimab, tocilizumab et bamlanivimab et étesevimab administrés ensemble 15,16,17,18,19. Il n’existe actuellement qu’un seul vaccin prophylactique approuvé par la FDA, Pfizer-BioNTech, et deux autres vaccins prophylactiques (Moderna et Janssen) ont été approuvéspar l’EUA 20,21,22,23,24. Cependant, avec le taux d’infection incontrôlé et l’émergence de la VoC et de la VoI, le SARS-CoV-2 constitue toujours une menace pour la santé humaine. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires de toute urgence pour identifier des prophylactiques et des traitements efficaces pour contrôler l’infection par le SRAS-CoV-2 et la pandémie de COVID-19 toujours en cours.
L’étude du SARS-CoV-2 nécessite des techniques laborieuses et des approches secondaires pour identifier la présence du virus dans les cellules infectées et/ou des modèles animaux d’infection validés. L’utilisation de la génétique inverse a permis la génération de virus recombinants pour répondre à des questions importantes dans la biologie des infections virales. Par exemple, les techniques de génétique inverse ont fourni des moyens de découvrir et de comprendre les mécanismes de l’infection virale, de la pathogenèse et de la maladie. De même, les approches de génétique inverse ont ouvert la voie à la conception de virus recombinants dépourvus de protéines virales pour comprendre leur contribution à la pathogenèse virale. En outre, des techniques de génétique inverse ont été utilisées pour générer des virus recombinants exprimant des gènes rapporteurs pour des applications in vitro et in vivo, y compris l’identification d’approches prophylactiques et / ou thérapeutiques pour le traitement des infections virales. Les protéines fluorescentes et bioluminescentes sont les gènes rapporteurs les plus couramment utilisés en raison de leur sensibilité, de leur stabilité et de leur facilité de détection basée sur l’amélioration des nouvelles technologies25,26. In vitro, il a été démontré que les protéines fluorescentes constituent une meilleure option pour la localisation des virus dans les cellules infectées, tandis que les luciférases sont plus pratiques pour les études de quantification 27,28,29. In vivo, les luciférases sont préférées aux protéines fluorescentes pour l’imagerie d’animaux entiers, tandis que les protéines fluorescentes sont préférées pour l’identification des cellules infectées ou l’imagerie ex vivo 30,31,32. L’utilisation de virus recombinants exprimant le rapporteur a servi d’outil puissant pour l’étude des virus dans de nombreuses familles, y compris, entre autres, les flavivirus, les entérovirus, les alphavirus, les lentivirus, les arénavirus et les virus de la grippe 28,33,34,35,36.
Pour surmonter le besoin d’approches secondaires pour étudier le SARS-CoV-2 et caractériser l’infection par le SARS-CoV-2 en temps réel in vivo, nous avons généré des protéines recombinantes (r)SARS-CoV-2 capables de réplication qui expriment des protéines bioluminescentes (nanoluciférase, Nluc) ou fluorescentes (Vénus) en utilisant notre génétique inverse basée sur les chromosomes artificiels bactériens (BAC) précédemment décrite, qui sont maintenues en une seule copie chez E. coli afin de minimiser la toxicité des séquences virales lors de sa propagation chez les bactéries37,38. Notamment, rSARS-CoV-2/Nluc et rSARS-CoV-2/Venus ont montré une pathogénicité de type rSARS-CoV-2/WT in vivo. Le niveau élevé d’expression de Vénus à partir de rSARS-CoV-2/Vénus a permis de détecter une infection virale dans les poumons de souris transgéniques K18 hACE2 infectées à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (IVIS)39. Les niveaux d’expression de Vénus étaient bien corrélés avec les titres viraux détectés dans les poumons, démontrant la faisabilité d’utiliser l’expression de Vénus comme substitut valide de l’infection par le SRAS-CoV-2. En utilisant rSARS-CoV-2/Nluc, nous avons pu suivre la dynamique de l’infection virale en temps réel et évaluer longitudinalement l’infection par le SARS-CoV-2 in vivo en utilisant la même approche IVIS chez des souris transgéniques K18 hACE2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole démontre la faisabilité de l’utilisation de ces gènes rapporteurs exprimant le rSARS-CoV-2 pour surveiller les infections virales in vivo. Les deux virus recombinants exprimant le rapporteur constituent un excellent outil pour étudier les infections par le SRAS-CoV-2 in vivo. Les systèmes d’imagerie ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) et in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) décrits représentent une excellente option pour comprendre la dynamique de l’infection par le SRAS-CoV-2,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres de notre institut (Texas Biomedical Research Institute) pour leurs efforts visant à maintenir nos installations pleinement opérationnelles et sûres pendant la pandémie de COVID-19. Nous tenons également à remercier notre Comité institutionnel de biosécurité (CIB) et notre orthographe (IACUC) d’avoir examiné nos protocoles de manière rapide. Nous remercions le Dr Thomas Moran de l’École de médecine Icahn du mont Sinaï d’avoir fourni l’anticorps monoclonal de la protéine nucléocapside (N) 1C7C7 réactif croisé du SRAS-CoV. La recherche sur le SARS-CoV-2 dans le laboratoire de Martinez-Sobrido est actuellement soutenue par les subventions NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 et R43AI165089-01; le Ministère de la Défense (DoD) accorde W81XWH2110095 et W81XWH2110103; le San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; le Texas Biomedical Research Institute Forum; le Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio; la Fondation médicale de San Antonio; et par le Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un centre d’excellence pour la recherche et la réponse à la grippe financé par le NIAID (CEIRR, contrat n° 75N93021C00014).
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
- V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
- Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
- Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
- Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
- Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
- Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
- Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
- Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
- Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
- Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
- Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
- Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
- . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
- Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
- Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
- Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
- Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
- O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
- Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
- Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
- Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
- Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
- Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
- Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
- Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
- Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
- Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).
