レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量
Summary
このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼおよび蛍光発現組換え(r)SARS-CoV-2およびインビボイメージングシステム(IVIS)を用いたウイルス感染のダイナミクスを記述している。
Abstract
コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされました。現在までに、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上の感染と490万人以上の死亡の原因となっています。他のウイルスと同様に、SARS-CoV-2の研究には、感染細胞および/または動物モデルにおけるウイルスの存在を検出するための実験方法の使用が必要である。この制限を克服するために、我々は、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製有能な組換え(r)SARS-CoV-2を作製した。これらのレポーター発現rSARS-CoV-2は、NlucおよびVenusレポーター遺伝子の発現に基づいて 、インビトロ および インビボでの ウイルス感染の追跡を可能にする。ここでの研究は、前述のK18ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)トランスジェニックマウス感染モデルにおけるSARS-CoV-2感染を検出および追跡するためのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusの使用を 、in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて説明する。このrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性およびウイルス複製を示す。重要なことに、NlucとVenusの発現により、感染したマウスのインビボ およびエクスビボでのウイルス感染を直接追跡することができます。これらのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは、 生体内でSARS-CoV-2の生物学を研究し、ウイルス感染および関連するCOVID-19疾患を理解し、SARS-CoV-2感染と戦うための効果的な予防的および/または治療的治療法を特定するための優れた選択肢です。
Introduction
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、コロナウイルス科1のベータコロナウイルス系統に属するエンベロープ、ポジティブセンス、一本鎖RNAウイルスです。このウイルスファミリーは、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルス1に分けられます。アルファコロナウイルスとベータコロナウイルスは主に哺乳類に感染しますが、ガンマコロナウイルスとデルタコロナウイルスはほぼ独占的に鳥類に感染します2。現在までに、7つのコロナウイルス(CoV)が種の障壁を越え、ヒトコロナウイルス(HCoV)として出現しました:2つのα-CoV(HCoV-229EおよびHCoV-NL63)と5つのβ-CoV(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中東呼吸器症候群コロナウイルス[MERS-CoV]、およびSARS-CoV-2)3、4、5、6。SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2は高病原性であり、重度の下気道感染症を引き起こす7。SARS-CoV-2の出現に先立ち、CoVsによって引き起こされる2つの流行性アウトブレイクがありました:2002年から2003年にかけて、中国の広東省プロビデンスにおけるSARS-CoV、症例致死率(CFR)は約9.7%でした。2012年から現在までの中東のMERS-CoVは、CFRが約34%です7,8。SARS-CoV-2の全体的なCFRは3.4%〜49%で、基礎となる条件がより高いCFR 8,9に寄与しています。2019年12月に中国の武漢で発見されて以来、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上のヒト感染と490万人以上の死亡の原因となっています7,10,11,12。特に、2020年後半以降、新しいSARS-CoV-2変異型(VoC)および関心のある変異型(VoI)は、感染および抗原性9,13、ならびにCOVID-19パンデミックの全体的な方向性を含むウイルス特性に影響を与えました。SARS-CoV-2感染症の治療のために、現在1つの米国(米国)しかありません。食品医薬品局(FDA)の治療用抗ウイルス薬(レムデシビル)および1種の緊急使用許可(EUA)薬(バリシチニブ、レムデシビルと組み合わせて投与される)14。また、6つの承認されたEUAモノクローナル抗体がある:REGEN-COV(カシリビマブおよびイムデビマブ、一緒に投与)、ソトロビマブ、トシリズマブ、およびバムラニビマブおよびエテセビマブを一緒に投与する15、16、17、18、19。現在、FDAが承認した予防ワクチンはファイザー・バイオNTechの1つしかなく、他の2つの予防ワクチン(モデルナとヤンセン)はEUAの承認を受けています20,21,22,23,24。しかし、制御不能な感染率とVoCとVoIの出現により、SARS-CoV-2は依然として人間の健康に脅威をもたらします。したがって、SARS-CoV-2感染と現在進行中のCOVID-19パンデミックを制御するための効率的な予防薬および治療法を特定するための新しいアプローチが緊急に必要とされています。
SARS-CoV-2を研究するには、感染細胞および/または感染の検証済み動物モデルにおけるウイルスの存在を特定するための面倒な技術および二次的アプローチが必要である。逆遺伝学の使用は、組換えウイルスの生成がウイルス感染の生物学における重要な質問に答えることを可能にした。例えば、リバースジェネティクス技術は、ウイルス感染、病因、および疾患のメカニズムを明らかにし、理解する手段を提供してきた。同様に、リバースジェネティクスのアプローチは、ウイルスの病因におけるそれらの寄与を理解するために、ウイルスタンパク質を欠く組換えウイルスを設計する道を開いた。さらに、ウイルス感染の治療のための予防的および/または治療的アプローチの同定を含む、in vitroおよびin vivo用途のためのレポーター遺伝子を発現する組換えウイルスを生成するために、リバースジェネティクス技術が使用されてきた。蛍光タンパク質および生物発光タンパク質は、その感度、安定性、および新技術の改善に基づく容易な検出のために、最も一般的に使用されるレポーター遺伝子である25,26。インビトロでは、蛍光タンパク質は感染細胞におけるウイルスの局在化のためのより良い選択肢として役立つことが示されているが、ルシフェラーゼは定量化研究にとってより便利である27、28、29。インビボでは、ルシフェラーゼは、全動物イメージングのための蛍光タンパク質よりも好ましいが、蛍光タンパク質は、感染細胞の同定またはエキソビボイメージング30、31、32のために好ましい。レポーター発現組換えウイルスの使用は、とりわけ、フラビウイルス、エンテロウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、アレナウイルス、およびインフルエンザウイルスを含む多くのファミリーにおけるウイルスの研究のための強力なツールとして役立ってきた28、33、34、35、36。
SARS-CoV-2を研究し、 生体内でのリアルタイムSARS-CoV-2感染を特徴付けるための二次的アプローチの必要性を克服するために、我々は、 大腸菌 において単一のコピーとして維持される前述の細菌人工染色体(BAC)ベースの逆遺伝学を使用して、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製能を有する組換え(r)SARS-CoV-2を生成した。 細菌におけるその増殖中のウイルス配列の毒性を最小限に抑えるために37、38。特に、rSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性を示した。rSARS-CoV-2/Venusからの高レベルの金星発現により、 in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて、感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの肺におけるウイルス感染を検出することができました39。金星発現のレベルは、肺で検出されたウイルス力価とよく相関し、SARS-CoV-2感染の有効な代理として金星発現を使用することの実現可能性を実証した。rSARS-CoV-2/Nlucを用いて、我々はウイルス感染のダイナミクスをリアルタイムで追跡し、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおける同じIVISアプローチを用いて 、インビボでの SARS-CoV-2感染を縦断的に評価することができた。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコールは、これらのrSARS-CoV-2発現レポーター遺伝子を使用して 、インビボでのウイルス感染を監視することの実現可能性を実証する。両方のレポーター発現組換えウイルスは、 インビボでSARS-CoV-2感染を研究するための優れたツールを提供する。記載された エクス ビボ(rSARS-CoV-2/Venus)および インビボ (rSARS-CoV-2/Nluc)イメージングシステムは、SARS-CoV-2感染?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究所(テキサス生物医学研究所)のメンバーには、COVID-19パンデミックの間、私たちの施設を完全に運営し、安全に保つための努力に感謝したいと思います。また、制度バイオセーフティ委員会(IBC)とスペル(IACUC)が、時間効率の良い方法でプロトコルを見直してくれたことに感謝します。シナイ山のアイカーン医科大学のトーマス・モラン博士が、SARS-CoV交差反応性1C7C7ヌクレオカプシド(N)タンパク質モノクローナル抗体を提供してくれたことに感謝します。マルティネス・ソブリドの研究室におけるSARS-CoV-2の研究は現在、NIAID/NIH助成金RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1、およびR43AI165089-01によって支援されています。国防総省(DoD)はW81XWH2110095およびW81XWH2110103を付与します。精密治療のためのサンアントニオパートナーシップ;テキサス生物医学研究所フォーラム;サンアントニオのテキサス大学健康科学センター。サンアントニオ医療財団;NIAIDが資金提供するインフルエンザ研究・対応センター(CEIRR、契約番号75N93021C00014)であるインフルエンザ病因・伝播研究センター(CRIPT)による。
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
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