JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

Published: November 05, 2021
doi:
10.3791/63127
, , , , ,
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Этот протокол описывает динамику вирусных инфекций с использованием люциферазы и флуоресцентно-экспрессирующих рекомбинантных (r)SARS-CoV-2 и систем визуализации in vivo (IVIS) у трансгенных мышей K18 hACE2 для преодоления необходимости вторичных подходов, необходимых для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo.

Abstract

Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) была вызвана тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2). На сегодняшний день SARS-CoV-2 является причиной более 242 миллионов инфекций и более 4,9 миллиона смертей во всем мире. Подобно другим вирусам, изучение SARS-CoV-2 требует использования экспериментальных методов для обнаружения присутствия вируса в инфицированных клетках и/или на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюцифераза, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки. Эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2 позволяют отслеживать вирусные инфекции in vitro и in vivo на основе экспрессии генов-репортеров Nluc и Venus. Здесь исследование описывает использование rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus для обнаружения и отслеживания инфекции SARS-CoV-2 в ранее описанной K18 человеческой ангиотензинпревращающей ферменте 2 (hACE2) трансгенной мышиной модели инфекции с использованием систем визуализации in vivo (IVIS). Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus демонстрируют rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность и репликацию вируса in vivo. Важно отметить, что экспрессия Nluc и Venus позволяет нам напрямую отслеживать вирусные инфекции in vivo и ex vivo у инфицированных мышей. Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus представляют собой отличный вариант для изучения биологии SARS-CoV-2 in vivo, понимания вирусной инфекции и связанного с ней заболевания COVID-19 и определения эффективных профилактических и/или терапевтических методов лечения для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2.

Introduction

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae 1. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус1. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц2. На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять бета-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома [MERS-CoV] и SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными, вызывая тяжелую инфекцию нижних дыхательных путей7. До появления SARS-CoV-2 было две эпидемические вспышки, вызванные CoVs: SARS-CoV в Провинции Гуандун, Китай, с 2002 по 2003 год, с коэффициентом летальности (CFR) около 9,7%; и БВРС-КоВ на Ближнем Востоке с 2012 г. по настоящее время, при этом CFR составляет около 34%7,8. SARS-CoV-2 имеет общий CFR между 3,4% -49%, при этом базовые условия способствуют более высокому CFR 8,9. С момента своего открытия в декабре 2019 года в Ухане, Китай, SARS-CoV-2 был ответственен за более чем 242 миллиона случаев инфицирования людей и более 4,9 миллиона человеческих смертей во всем мире 7,10,11,12. Примечательно, что с конца 2020 года новые вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 (VoC) и интересующие их варианты (VoI) повлияли на характеристики вируса, включая передачу и антигенность 9,13, а также на общее направление пандемии COVID-19. Для лечения инфекций SARS-CoV-2 в настоящее время существует только один Соединенные Штаты (США). Терапевтический противовирусный препарат Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (ремдесивир) и один препарат с разрешением на экстренное использование (EUA) (барицитиниб, вводимый в комбинации с ремдесивиром)14. Существует также 6 одобренных моноклональных антител EUA: REGEN-COV (казиривимаб и имдевимаб, вводимые вместе), сотровимаб, тоцилизумаб, бамланивимаб и этесевимаб, вводимые вместе 15,16,17,18,19. В настоящее время существует только одна одобренная FDA профилактическая вакцина, Pfizer-BioNTech, и две другие профилактические вакцины (Moderna и Janssen) были одобрены EUA 20,21,22,23,24. Однако при неконтролируемом уровне инфицирования и появлении VoC и VoI SARS-CoV-2 по-прежнему представляет угрозу для здоровья человека. Поэтому срочно необходимы новые подходы для выявления эффективных профилактических и терапевтических средств для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 и все еще продолжающейся пандемией COVID-19.

Изучение SARS-CoV-2 требует трудоемких методов и вторичных подходов для выявления присутствия вируса в инфицированных клетках и / или проверенных животных моделях инфекции. Использование обратной генетики позволило генерации рекомбинантных вирусов ответить на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Например, методы обратной генетики предоставили средства для выявления и понимания механизмов вирусной инфекции, патогенеза и болезни. Аналогичным образом, подходы обратной генетики проложили путь к разработке рекомбинантных вирусов, лишенных вирусных белков, чтобы понять их вклад в вирусный патогенез. Кроме того, методы обратной генетики были использованы для генерации рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены для применения in vitro и in vivo, включая выявление профилактических и/или терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций. Флуоресцентные и биолюминесцентные белки являются наиболее часто используемыми репортерными генами из-за их чувствительности, стабильности и легкости обнаружения на основе совершенствования новых технологий25,26. Было показано, что флуоресцентные белки in vitro служат лучшим вариантом локализации вирусов в инфицированных клетках, в то время как люциферазы более удобны для количественных исследований 27,28,29. In vivo люциферазы предпочтительнее флуоресцентных белков для визуализации целых животных, в то время как флуоресцентные белки предпочтительны для идентификации инфицированных клеток или визуализации ex vivo 30,31,32. Использование репортер-экспрессирующих рекомбинантных вирусов послужило мощным инструментом для изучения вирусов во многих семействах, включая, среди прочего, флавивирусы, энтеровирусы, альфавирусы, лентивирусы, аренавирусы и вирусы гриппа 28,33,34,35,36.

Чтобы преодолеть потребность во вторичных подходах к изучению SARS-CoV-2 и охарактеризовать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo в реальном времени, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюциферазы, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки, используя нашу ранее описанную обратную генетику на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC), которые поддерживаются как единая копия в E. colili с целью минимизации токсичности последовательностей вируса при его размножении в бактериях37,38. Примечательно, что rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus показали rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность in vivo. Высокий уровень экспрессии Венеры от rSARS-CoV-2/Venus позволил обнаружить вирусную инфекцию в легких инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью системы визуализации in vivo (IVIS)39. Уровни экспрессии Венеры хорошо коррелировали с вирусными титрами, обнаруженными в легких, демонстрируя возможность использования экспрессии Венеры в качестве действительного суррогата инфекции SARS-CoV-2. Используя rSARS-CoV-2/Nluc, мы смогли отслеживать динамику вирусной инфекции в режиме реального времени и продольно оценивать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo, используя тот же подход IVIS у трансгенных мышей K18 hACE2.

Protocol

Протоколы с участием трансгенных мышей K18 hACE2 были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) Техасского биомедицинского научно-исследовательского института (TBRI) и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все эксперименты проводятся…

Representative Results

Инфекция rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 1 и 2)На рисунке 1А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций in vivo. На рисунке 1B показана схематиче?…

Discussion

Этот протокол демонстрирует возможность использования этих rSARS-CoV-2 экспрессирующих репортерных генов для мониторинга вирусных инфекций in vivo. Оба репортер-экспрессирующих рекомбинантных вируса являются отличным инструментом для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo. Описанные систе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить членов нашего института (Техасского института биомедицинских исследований) за их усилия по поддержанию наших объектов в полной рабочем состоянии и безопасности во время пандемии COVID-19. Мы также хотели бы поблагодарить наш Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) и Spell (IACUC) за обзор наших протоколов эффективным по времени образом. Мы благодарим доктора Томаса Морана из Медицинской школы Айкана на горе Синай за предоставление моноклонального антитела к протоклональному белку нуклеокапсида (N) sarS-CoV с перекрестным реактивным 1C7C7 (N). Исследования SARS-CoV-2 в лаборатории Мартинеса-Собридо в настоящее время поддерживаются грантами NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 и R43AI165089-01; Министерство обороны (DoD) предоставляет гранты W81XWH2110095 и W81XWH2110103; Партнерство Сан-Антонио по прецизионной терапии; Форум Техасского института биомедицинских исследований; Научный центр здравоохранения Техасского университета в Сан-Антонио; Медицинский фонд Сан-Антонио; и Центром исследований патогенеза и передачи гриппа (CRIPT), финансируемым NIAID Центром передового опыта в области исследований и реагирования на грипп (CEIRR, контракт No 75N93021C00014).

Materials

0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Keywords: Live ImagingQuantificationViral InfectionK18 HACE2 Transgenic MiceReporter-expressing Recombinant SARS-CoV-2In VivoEx VivoFluorescenceBioluminescenceLuciferaseIVISLungsNecropsy
check_url/kr/63127?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image