Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2
Summary
Este protocolo descreve a dinâmica das infecções virais usando recombinação expressante (r)SARS-CoV-2 e um sistema de imagem in vivo (IVIS) em camundongos transgênicos K18 hACE2 para superar a necessidade de abordagens secundárias necessárias para estudar infecções sars-cov-2 in vivo.
Abstract
A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) foi causada por síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Até o momento, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções e mais de 4,9 milhões de mortes em todo o mundo. Semelhante a outros vírus, estudar o SARS-CoV-2 requer o uso de métodos experimentais para detectar a presença de vírus em células infectadas e/ou em modelos animais. Para superar essa limitação, geramos proteínas recombinantes competentes para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus). Estes rSARS-CoV-2 que expressam repórteres permitem rastrear infecções virais in vitro e in vivo com base na expressão dos genes de repórteres de Nluc e Vênus. Aqui, o estudo descreve o uso de rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus para detectar e rastrear a infecção pelo SARS-CoV-2 no modelo de infecção transgênica K18(IVIS) da enzima de conversão de angiotensina humana anteriormente descrita. Este rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostram rSARS-CoV-2/WT-like patogenicidade e replicação viral in vivo. É importante ressaltar que a expressão de Niuc e Vênus nos permite rastrear diretamente infecções virais in vivo e ex vivo, em camundongos infectados. Estes rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus representam uma excelente opção para estudar a biologia do SARS-CoV-2 in vivo, para entender a infecção viral e a doença COVID-19 associada, e identificar tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos eficazes para combater a infecção pelo SARS-CoV-2.
Introduction
Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é um vírus RNA envolto, de sentido positivo e de uma única cadeia que pertence à linhagem Betacoronavírus na família Coronaviridae 1. Esta família viral é dividida em Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Alfa e Betacoronavírus infectam principalmente mamíferos, enquanto Gamma e Deltacoronavirus infectam quase exclusivamente aves2. Até o momento, sete coronavírus (CoV) cruzaram barreiras de espécies e emergiram como coronavírus humanos (HCoV): dois alfa-CoVs (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinco beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Síndrome Respiratória do Oriente Médio coronavírus [MERS-CoV], e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 são altamente patogênicos, causando infecção grave do trato respiratório inferior7. Antes do surgimento do SARS-CoV-2, houve dois surtos epidêmicos causados por CoVs: SARS-CoV em Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, com uma taxa de letalidade por casos (CFR) de cerca de 9,7%; e MERS-CoV no Oriente Médio de 2012 até hoje, com uma CFR de cerca de 34%7,8. O SARS-CoV-2 possui uma CFR global entre 3,4%-49%, com condições subjacentes contribuindo para uma CFR mais altade 8,9. Desde sua descoberta em dezembro de 2019, em Wuhan, China, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções humanas e mais de 4,9 milhões de mortes humanas em todo o mundo, 7,10,11,12. Notavelmente, desde o final de 2020, novas variantes sars-CoV-2 de preocupação (VoC) e variantes de interesse (VoI) têm impactado características do vírus, incluindo transmissão e antigenicidade 9,13, e a direção geral da pandemia COVID-19. Para o tratamento de infecções por SARS-CoV-2, atualmente existe apenas um Estados Unidos (EUA) Food and Drug Administration (FDA) antiviral (remdesivir) e um medicamento de Autorização de Uso de Emergência (EUA) (baricitinib, a ser administrado em combinação com remdesivir)14. Há também 6 anticorpos monoclonais EUA aprovados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumabe, e bamlanivimab e etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Atualmente, apenas uma vacina profilática aprovada pela FDA, a Pfizer-BioNTech, e duas outras vacinas profiláticas (Moderna e Janssen) foram aprovadas pela EUA 20,21,22,23,24. No entanto, com a taxa de infecção descontrolada e o surgimento de VoC e VoI, o SARS-CoV-2 ainda representa uma ameaça à saúde humana. Portanto, novas abordagens são urgentemente necessárias para identificar profiláticas eficientes e terapêuticas para controlar a infecção pelo SARS-CoV-2 e a pandemia COVID-19 ainda em curso.
Estudar o SARS-CoV-2 requer técnicas laboriosas e abordagens secundárias para identificar a presença do vírus em células infectadas e/ou modelos animais validados de infecção. O uso da genética reversa permitiu que a geração de vírus recombinantes respondesse a questões importantes na biologia das infecções virais. Por exemplo, técnicas de genética reversa forneceram meios para descobrir e entender os mecanismos de infecção viral, patogênese e doenças. Da mesma forma, abordagens genéticas reversas abriram caminho para projetar vírus recombinantes sem proteínas virais para entender sua contribuição na patogênese viral. Além disso, técnicas de genética reversa têm sido utilizadas para gerar vírus recombinantes expressando genes repórteres para aplicações in vitro e in vivo, incluindo a identificação de abordagens profiláticas e/ou terapêuticas para o tratamento de infecções virais. Proteínas fluorescentes e bioluminescentes são os genes repórteres mais comumente usados devido à sua sensibilidade, estabilidade e fácil detecção com base na melhoria das novas tecnologias25,26. In vitro, as proteínas fluorescentes têm sido mostradas como uma melhor opção para a localização de vírus em células infectadas, enquanto as luciferases são mais convenientes para estudos de quantificação 27,28,29. In vivo, as luciferases são preferidas em vez de proteínas fluorescentes para imagens animais inteiras, enquanto as proteínas fluorescentes são preferidas para a identificação de células infectadas ou ex vivo imaging 30,31,32. O uso de vírus recombinantes que expressam repórteres tem servido como uma poderosa ferramenta para o estudo de vírus em muitas famílias, incluindo, entre outros, flavivírus, enterovírus, alfavírus, lentivírus, arenavírus e vírus da gripe 28,33,34,35,36.
Para superar a necessidade de abordagens secundárias para estudar SARS-CoV-2 e caracterizar a infecção em tempo real sars-CoV-2 in vivo, geramos recombinação competente para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus) usando nossas genéticas reversas baseadas em cromossomos artificiais bacterianos (BAC), que são mantidas como uma única cópia em E. a fim de minimizar a toxicidade das sequências de vírus durante sua propagação em bactérias37,38. Notavelmente, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostraram patogenicidade em forma de rSARS-CoV-2/WT in vivo. O alto nível de expressão de Vênus a partir de rSARS-CoV-2/Vênus permitiu detectar infecção viral nos pulmões de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados usando um sistema de imagem in vivo (IVIS)39. Os níveis de expressão de Vênus correlacionavam-se bem com os títulos virais detectados nos pulmões, demonstrando a viabilidade de usar a expressão de Vênus como um substituto válido da infecção por SARS-CoV-2. Utilizando a infecção rSARS-CoV-2/Nluc, pudemos rastrear a dinâmica da infecção viral em tempo real e avaliar longitudinalmente a infecção pelo SARS-CoV-2 in vivo usando a mesma abordagem IVIS em camundongos transgênicos K18 hACE2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demonstra a viabilidade do uso desses rSARS-CoV-2 expressando genes repórteres para monitorar infecções virais in vivo. Ambos os vírus recombinantes que expressam repórteres fornecem uma excelente ferramenta para estudar infecções pelo SARS-CoV-2 in vivo. Os sistemas de imagem ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) representam uma excelente opção para entender a dinâmica da infecção pelo SARS-CoV-2, a patogênese viral e identificar células…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros do nosso instituto (Texas Biomedical Research Institute) por seus esforços em manter nossas instalações totalmente operacionais e seguras durante a pandemia COVID-19. Gostaríamos também de agradecer ao nosso Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) e ao Feitiço (IACUC) por revisar nossos protocolos de forma eficiente. Agradecemos ao Dr. Thomas Moran da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai por fornecer o anticorpo monoclonal de proteína sars-CoV 1C7C7 (N) proteína. A pesquisa SARS-CoV-2 no laboratório de Martinez-Sobrido é atualmente apoiada pelas bolsas NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; o Departamento de Defesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; a Parceria de San Antonio para a Precision Therapeutic; o Fórum do Instituto de Pesquisa Biomédica do Texas; o Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio; a Fundação Médica de San Antonio; e pelo Centro de Pesquisa em Patogênese e Transmissão da Influenza (CRIPT), um Centro de Excelência para Pesquisa e Resposta à Influenza (CEIRR, contrato nº 75N93021C00014).
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
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