הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדינמיקה של זיהומים נגיפיים באמצעות לוציפראז ופלואורסצנציה המבטאת רקומביננט (r)SARS-CoV-2 ומערכות הדמיה in vivo (IVIS) בעכברים מהונדסים K18 hACE2 כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות הנדרשות לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo.
Abstract
מגיפת מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) נגרמה על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2). עד כה, SARS-CoV-2 היה אחראי ליותר מ-242 מיליון זיהומים וליותר מ-4.9 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. בדומה לנגיפים אחרים, חקר SARS-CoV-2 דורש שימוש בשיטות ניסיוניות כדי לזהות נוכחות של נגיף בתאים נגועים ו/או במודלים של בעלי חיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, יצרנו רקומביננטים בעלי יכולת שכפול (r)SARS-CoV-2 המבטאים חלבונים ביולומינסנטיים (ננולציפראז, נלוק) או פלואורסצנטיים (נוגה). rSARS-CoV-2 אלה המבטאים כתבים מאפשרים לעקוב אחר זיהומים נגיפיים במבחנה וב-in vivo בהתבסס על ביטוי הגנים של Nluc ו-Venus reporter. כאן המחקר מתאר את השימוש ב- rSARS-CoV-2/Nluc ו- rSARS-CoV-2/Venus כדי לזהות ולעקוב אחר זיהום SARS-CoV-2 במודל העכברים הממירים את האנגיוטנסין האנושי K18 שתואר קודם לכן 2 (hACE2) של זיהום באמצעות מערכות הדמיה in vivo (IVIS). rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus מראים פתוגניות דמוית rSARS-CoV-2/WT ושכפול נגיפי in vivo. חשוב לציין כי ביטויי Nluc ו-Venus מאפשרים לנו לעקוב ישירות אחר זיהומים נגיפיים ב-vivo וב-ex vivo, בעכברים נגועים. rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus מייצגים אפשרות מצוינת לחקור את הביולוגיה של SARS-CoV-2 in vivo, להבין זיהום ויראלי ומחלת COVID-19 הקשורה אליו, ולזהות טיפולים מניעתיים ו/או טיפוליים יעילים למאבק בזיהום SARS-CoV-2.
Introduction
תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) הוא נגיף RNA עטוף, בעל חוש חיובי וחד-גדילי השייך לשושלת בטאקורונה-וירוס במשפחת הקורונה 1. משפחה ויראלית זו מחולקת לאלפא, בטא, גמא ודלתא-קורונה1. נגיפי אלפא ובטאקורונה מדביקים בעיקר יונקים, בעוד שנגיף גמא ודלתא-קורונה מדביק כמעט אך ורק ציפורים2. עד כה, שבעה נגיפי קורונה (CoV) חצו מחסומי מינים והתפתחו כנגיפי קורונה אנושיים (HCoV): שני אלפא-CoVs (HCoV-229E ו-HCoV-NL63) וחמישה רכבי בטא-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, נגיף הקורונה של תסמונת הנשימה במזרח התיכון [MERS-CoV], ו-SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV ו-SARS-CoV-2 הם פתוגניים מאוד, וגורמים לזיהום חמור בדרכי הנשימה התחתונות7. לפני הופעתו של SARS-CoV-2, היו שתי התפרצויות מגיפה שנגרמו על ידי CoVs: SARS-CoV בגואנגדונג פרובידנס, סין, בין השנים 2002-2003, עם שיעור תמותה ממקרי תמותה (CFR) של כ-9.7%; ו-MERS-CoV במזרח התיכון משנת 2012 ועד היום, עם CFR של כ-34%7,8. ל-SARS-CoV-2 יש CFR כולל בין 3.4%-49%, כאשר מחלות רקע תורמות ל-CFR גבוה יותרשל 8,9%. מאז גילויו בדצמבר 2019, בווהאן, סין, SARS-CoV-2 אחראי ליותר מ-242 מיליון נדבקים בבני אדם וליותר מ-4.9 מיליון מקרי מוות של בני אדם ברחבי העולם, 7,10,11,12. יש לציין כי מאז סוף 2020, וריאנטים חדשים של SARS-CoV-2 של דאגה (VoC) ווריאנטים בעלי עניין (VoI) השפיעו על מאפייני הנגיף, כולל העברה ואנטיגניות 9,13, והכיוון הכללי של מגיפת COVID-19. לטיפול בזיהומי SARS-CoV-2, יש כיום רק ארצות הברית אחת (ארה”ב) מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) טיפול אנטי-ויראלי (remdesivir) ותרופה אחת לאישור שימוש חירום (EUA) (baricitinib, שתינתן בשילוב עם remdesivir)14. ישנם גם 6 נוגדנים חד שבטיים מאושרים של EUA: REGEN-COV (casirivimab ו- imdevimab, הניתנים יחד), sotrovimab, tocilizumab, ו- bamlanivimab ו- etesevimab המנוהלים יחד 15,16,17,18,19. נכון לעכשיו יש רק חיסון מניעתי אחד שאושר על ידי ה-FDA, פייזר-ביונטק, ושני חיסונים מניעתיים אחרים (מודרנה וג’נסן) אושרו על ידי EUA 20,21,22,23,24. עם זאת, עם שיעור ההדבקה הבלתי מבוקר והופעתם של VoC ו- VoI, SARS-CoV-2 עדיין מהווה איום על בריאות האדם. לכן, יש צורך דחוף בגישות חדשות כדי לזהות מניעה וטיפולים יעילים לשליטה בהדבקת SARS-CoV-2 ובמגפת COVID-19 שעדיין נמשכת.
חקר SARS-CoV-2 דורש טכניקות מייגעות וגישות משניות כדי לזהות את נוכחות הנגיף בתאים נגועים ו/או מודלים מאומתים של זיהום בבעלי חיים. השימוש בגנטיקה הפוכה איפשר ליצירת וירוסים רקומביננטיים לענות על שאלות חשובות בביולוגיה של זיהומים ויראליים. לדוגמה, טכניקות של גנטיקה הפוכה סיפקו אמצעים לחשוף ולהבין את המנגנונים של זיהום ויראלי, פתוגנזה ומחלות. באופן דומה, גישות לגנטיקה הפוכה סללו את הדרך להנדס וירוסים רקומביננטיים חסרי חלבונים נגיפיים כדי להבין את תרומתם בפתוגנזה נגיפית. בנוסף, נעשה שימוש בטכניקות של גנטיקה הפוכה כדי ליצור וירוסים רקומביננטיים המבטאים גנים מדווחים ליישומי in vitro ו-in vivo, כולל זיהוי גישות מניעתיות ו/או טיפוליות לטיפול בזיהומים נגיפיים. חלבונים פלואורסצנטיים וביולומינסצנטיים הם הגנים המדווחים הנפוצים ביותר בשל הרגישות, היציבות והזיהוי הקל שלהם בהתבסס על שיפור טכנולוגיות חדשות25,26. במבחנה, חלבונים פלואורסצנטיים הוכחו כאפשרות טובה יותר ללוקליזציה של וירוסים בתאים נגועים, בעוד שלוציפראזות נוחות יותר למחקרי כימות 27,28,29. In vivo, לוציפראזות עדיפות על פני חלבונים פלואורסצנטיים להדמיה של בעלי חיים שלמים, בעוד שחלבונים פלואורסצנטיים מועדפים לזיהוי תאים נגועים או הדמיית ex vivo 30,31,32. השימוש בנגיפים רקומביננטיים המבטאים כתבים שימש ככלי רב עוצמה לחקר וירוסים במשפחות רבות, כולל, בין היתר, פלבי-וירוסים, אנטרו-וירוסים, אלפא-וירוסים, לנטי-וירוסים, נגיפי ארנה ונגיפי שפעת 28,33,34,35,36.
כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות לחקר SARS-CoV-2 ולאפיון זיהום SARS-CoV-2 בזמן אמת in vivo, יצרנו רקומביננטים (r)SARS-CoV-2 המוכשרים לשכפול המבטאים חלבונים ביולומינסנטיים (ננולוסיפראז, Nluc) או פלואורסצנטיים (Venus) באמצעות הגנטיקה ההפוכה המבוססת על כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BAC) שתוארו קודם לכן, המתוחזקים כעותק יחיד ב– E. coli על מנת למזער את הרעילות של רצפי הנגיף במהלך התפשטותו בחיידקים37,38. יש לציין כי rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus הראו פתוגניות דמוית rSARS-CoV-2/WT in vivo. הרמה הגבוהה של ביטוי נוגה מ-rSARS-CoV-2/Venus אפשרה זיהוי זיהום נגיפי בריאות של עכברים מהונדסים K18 hACE2 נגועים באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS)39. רמות הביטוי של נוגה תאמו היטב עם טיטרים נגיפיים שזוהו בריאות, והדגימו את ההיתכנות של שימוש בביטוי נוגה כפונדקאית תקפה של זיהום SARS-CoV-2. באמצעות rSARS-CoV-2/Nluc, הצלחנו לעקוב אחר הדינמיקה של זיהום נגיפי בזמן אמת ולהעריך באופן אורכי את זיהום SARS-CoV-2 in vivo באמצעות אותה גישת IVIS בעכברים מהונדסים K18 hACE2.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את ההיתכנות של שימוש בגנים אלה של rSARS-CoV-2 המבטאים את הכתבים כדי לנטר זיהומים ויראליים in vivo. שני הנגיפים הרקומביננטיים המבטאים כתבים מספקים כלי מצוין לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo. מערכות ההדמיה המתוארות ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) ו-in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) מייצגות אפשרות מצוינת לה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לחברים במכון שלנו (מכון המחקר הביו-רפואי של טקסס) על מאמציהם לשמור על המתקנים שלנו פעילים ובטוחים באופן מלא במהלך מגיפת COVID-19. אנו רוצים גם להודות לוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית שלנו (IBC) ולאיות (IACUC) על סקירת הפרוטוקולים שלנו בצורה יעילה בזמן. אנו מודים לד”ר תומס מורן מבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני על שסיפק את הנוגדן החד-שבטי של חלבון הנוקליאוקפסיד 1C7C7 (N) המגיב SARS-CoV. מחקר SARS-CoV-2 במעבדתו של מרטינז-סוברידו נתמך כיום על ידי מענקי NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 ו-R43AI165089-01; משרד ההגנה (DoD) מעניק את W81XWH2110095 ואת W81XWH2110103; שותפות סן אנטוניו לטיפול מדויק; פורום מכון המחקר הביו-רפואי בטקסס; המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו; הקרן הרפואית של סן אנטוניו; ועל ידי המרכז לחקר פתוגנזה והעברה של שפעת (CRIPT), מרכז מצוינות במימון NIAID למחקר ותגובה לשפעת (CEIRR, חוזה # 75N93021C00014).
Materials
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
- V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
- Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
- Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
- Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
- Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
- Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
- Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
- Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
- Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
- Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
- Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
- Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
- . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
- Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
- Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
- Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
- Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
- O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
- Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
- Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
- Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
- Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
- Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
- Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
- Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
- Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
- Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).
