Este protocolo describe la dinámica de las infecciones virales utilizando luciferasa y fluorescencia recombinante (r)SARS-CoV-2 y un sistema de imágenes in vivo (IVIS) en ratones transgénicos K18 hACE2 para superar la necesidad de enfoques secundarios necesarios para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo.
La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha sido causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Hasta la fecha, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones y más de 4,9 millones de muertes en todo el mundo. Al igual que otros virus, el estudio del SARS-CoV-2 requiere el uso de métodos experimentales para detectar la presencia del virus en células infectadas y/o en modelos animales. Para superar esta limitación, generamos proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 recombinantes (r) competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluciferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus). Estos rSARS-CoV-2 que expresan reporteros permiten rastrear infecciones virales in vitro e in vivo en función de la expresión de los genes reporteros Nluc y Venus. Aquí el estudio describe el uso de rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus para detectar y rastrear la infección por SARS-CoV-2 en el modelo de infección de ratón transgénico K18 de enzima convertidora de angiotensina humana K18 (hACE2) previamente descrito utilizando sistemas de imágenes in vivo (IVIS). Este rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus muestran patogenicidad similar a rSARS-CoV-2/WT y replicación viral in vivo. Es importante destacar que la expresión de Nluc y Venus nos permite rastrear directamente las infecciones virales in vivo y ex vivo, en ratones infectados. Estos rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus representan una excelente opción para estudiar la biología del SARS-CoV-2 in vivo, comprender la infección viral y la enfermedad COVID-19 asociada, e identificar tratamientos profilácticos y/o terapéuticos efectivos para combatir la infección por SARS-CoV-2.
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) es un virus de ARN monocatenario envuelto, de sentido positivo y que pertenece al linaje Betacoronavirus de la familia Coronaviridae 1. Esta familia viral se divide en Alfa-, Beta-, Gamma-, y Delta-coronavirus1. Los alfa y betacoronavirus infectan principalmente a los mamíferos, mientras que los gamma y deltacoronavirus infectan casi exclusivamente a las aves2. Hasta la fecha, siete coronavirus (CoV) han cruzado las barreras de las especies y han surgido como coronavirus humanos (HCoV): dos alfa-CoV (HCoV-229E y HCoV-NL63) y cinco beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio [MERS-CoV] y SARS-CoV-2)3,4,5,6. El SARS-CoV, el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 son altamente patógenos y causan una infección grave del tracto respiratorio inferior7. Antes de la aparición del SARS-CoV-2, hubo dos brotes epidémicos causados por coV: SARS-CoV en Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, con una tasa de letalidad (CFR) de alrededor del 9,7%; y el MERS-CoV en Oriente Medio desde 2012 hasta la actualidad, con un MCR de alrededor del 34%7,8. El SARS-CoV-2 tiene un CFR general entre el 3,4% y el 49%, y las condiciones subyacentes contribuyen a un CFRmás alto de 8,9. Desde su descubrimiento en diciembre de 2019, en Wuhan, China, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones humanas y más de 4,9 millones de muertes humanas en todo el mundo 7,10,11,12. En particular, desde finales de 2020, las nuevas variantes de preocupación (VoC) y las variantes de interés (VoI) del SARS-CoV-2 han afectado las características del virus, incluida la transmisión y la antigenicidad 9,13, y la dirección general de la pandemia de COVID-19. Para el tratamiento de las infecciones por SARS-CoV-2, actualmente solo hay un Estados Unidos (EE. UU.) Antiviral terapéutico (remdesivir) de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y un medicamento de Autorización de Uso de Emergencia (EUA) (baricitinib, que se administrará en combinación con remdesivir)14. También hay 6 anticuerpos monoclonales EUA aprobados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumab y bamlanivimab y etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Actualmente solo hay una vacuna profiláctica aprobada por la FDA, Pfizer-BioNTech, y otras dos vacunas profilácticas (Moderna y Janssen) han sido aprobadas por la EUA 20,21,22,23,24. Sin embargo, con la tasa de infección no controlada y la aparición de VoC y VoI, el SARS-CoV-2 todavía representa una amenaza para la salud humana. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques para identificar profilácticos y terapias eficientes para controlar la infección por SARS-CoV-2 y la pandemia de COVID-19 aún en curso.
El estudio del SARS-CoV-2 requiere técnicas laboriosas y enfoques secundarios para identificar la presencia del virus en células infectadas y/o modelos animales validados de infección. El uso de la genética inversa ha permitido la generación de virus recombinantes para responder a preguntas importantes en la biología de las infecciones virales. Por ejemplo, las técnicas de genética inversa han proporcionado medios para descubrir y comprender los mecanismos de la infección viral, la patogénesis y la enfermedad. Del mismo modo, los enfoques de genética inversa han allanado el camino para diseñar virus recombinantes que carecen de proteínas virales para comprender su contribución en la patogénesis viral. Además, se han utilizado técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes que expresan genes reporteros para aplicaciones in vitro e in vivo, incluida la identificación de enfoques profilácticos y/o terapéuticos para el tratamiento de infecciones virales. Las proteínas fluorescentes y bioluminiscentes son los genes reporteros más utilizados debido a su sensibilidad, estabilidad y fácil detección basada en la mejora de las nuevas tecnologías25,26. In vitro, se ha demostrado que las proteínas fluorescentes sirven como una mejor opción para la localización de virus en células infectadas, mientras que las luciferasas son más convenientes para estudios de cuantificación 27,28,29. In vivo, las luciferasas son preferidas sobre las proteínas fluorescentes para imágenes de animales enteros, mientras que las proteínas fluorescentes son preferidas para la identificación de células infectadas o imágenes ex vivo 30,31,32. El uso de virus recombinantes que expresan reporteros ha servido como una poderosa herramienta para el estudio de virus en muchas familias, incluyendo, entre otros, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus y virus de la influenza 28,33,34,35,36.
Para superar la necesidad de enfoques secundarios para estudiar el SARS-CoV-2 y caracterizar la infección por SARS-CoV-2 en tiempo real in vivo, hemos generado proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus) utilizando nuestra genética inversa basada en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) previamente descrita, que se mantiene como una sola copia en E. coli coli con el fin de minimizar la toxicidad de las secuencias de virus durante su propagación en bacterias37,38. En particular, rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus mostraron patogenicidad similar a rSARS-CoV-2 / WT in vivo. El alto nivel de expresión de Venus a partir de rSARS-CoV-2/Venus permitió detectar infección viral en los pulmones de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS)39. Los niveles de expresión de Venus se correlacionaron bien con los títulos virales detectados en los pulmones, lo que demuestra la viabilidad de usar la expresión de Venus como un sustituto válido de la infección por SARS-CoV-2. Usando rSARS-CoV-2/Nluc, pudimos rastrear la dinámica de la infección viral en tiempo real y evaluar longitudinalmente la infección por SARS-CoV-2 in vivo utilizando el mismo enfoque IVIS en ratones transgénicos K18 hACE2.
Este protocolo demuestra la viabilidad de utilizar estos genes reporteros que expresan rSARS-CoV-2 para monitorear infecciones virales in vivo. Ambos virus recombinantes que expresan reporteros proporcionan una excelente herramienta para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo. Los sistemas de imágenes ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritos representan una excelente opción para comprender la dinámica de la infección por SARS-CoV-2, la patogénesi…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los miembros de nuestro instituto (Instituto de Investigación Biomédica de Texas) por sus esfuerzos para mantener nuestras instalaciones completamente operativas y seguras durante la pandemia de COVID-19. También nos gustaría agradecer a nuestro Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) y hechizo (IACUC) por revisar nuestros protocolos de una manera eficiente en el tiempo. Agradecemos al Dr. Thomas Moran de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por proporcionar el anticuerpo monoclonal de la proteína 1C7C7 (N) de reactiva cruzada del SARS-CoV. La investigación del SARS-CoV-2 en el laboratorio de Martínez-Sobrido cuenta actualmente con el apoyo de las subvenciones del NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 y R43AI165089-01; el Departamento de Defensa (DoD) otorga W81XWH2110095 y W81XWH2110103; la Asociación de San Antonio para La Terapéutica de Precisión; el Foro del Instituto de Investigación Biomédica de Texas; el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio; la Fundación Médica San Antonio; y por el Centro de Investigación sobre Patogénesis y Transmisión de la Influenza (CRIPT), un Centro de Excelencia para la Investigación y Respuesta a la Influenza financiado por el NIAID (CEIRR, contrato # 75N93021C00014).
0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Agar | Oxoid | LP0028 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |