Summary
Высокопроизводительный скрининг РНК-интерференции (РНКи) с использованием пула лентивирусных шРНК может быть инструментом для обнаружения терапевтически значимых синтетических смертельных целей при злокачественных новообразованиях. Мы предоставляем объединенный подход к скринингу шРНК для исследования эпигенетических эффекторов при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ).
Abstract
Понимание клинически значимых драйверных механизмов приобретенной химиорезистентности имеет решающее значение для выяснения способов обхода резистентности и улучшения выживаемости у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Небольшая часть лейкемических клеток, которые выживают после химиотерапии, имеют уравновешенное эпигенетическое состояние, чтобы переносить химиотерапевтический инсульт. Дальнейшее воздействие химиотерапии позволяет этим персистентным клеткам достичь фиксированного эпигенетического состояния, что приводит к изменению экспрессии генов, что приводит к пролиферации этих лекарственно-устойчивых популяций и в конечном итоге к рецидиву или рефрактерному заболеванию. Поэтому выявление эпигенетических модуляций, которые требуют выживания лекарственно-устойчивых лейкемических клеток, имеет решающее значение. Мы подробно описываем протокол для идентификации эпигенетических модуляторов, которые опосредуют устойчивость к нуклеозидному аналогу цитарабина (AraC) с использованием объединенного скрининга библиотеки шРНК в приобретенной цитарабин-резистентной клеточной линии AML. Библиотека состоит из 5 485 конструкций шРНК, нацеленных на 407 эпигенетических факторов человека, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг эпигенетических факторов.
Introduction
Терапевтические варианты при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) оставались неизменными в течение почти последних пяти десятилетий, с цитарабином (AraC) и антрациклинами в качестве краеугольного камня для лечения заболевания. Одной из проблем успеха терапии ОМЛ является устойчивость лейкемических стволовых клеток к химиотерапии, приводящая к рецидиву заболевания 1,2. Эпигенетическая регуляция играет жизненно важную роль в патогенезе рака и лекарственной устойчивости, и несколько эпигенетических факторов стали перспективными терапевтическими мишенями 3,4,5. Эпигенетические регуляторные механизмы влияют на пролиферацию и выживаемость при постоянном воздействии химиотерапевтических препаратов. Исследования в негематологических злокачественных новообразованиях показали, что небольшая часть клеток, которые преодолевают эффект препарата, подвергаются различным эпигенетическим модификациям, в результате чего выживаемость этих клетоксоставляет 6,7. Однако роль эпигенетических факторов в опосредовании приобретенной резистентности к цитарабину при ОМЛ не изучена.
Высокопроизводительный скрининг - это подход к открытию лекарств, который со временем приобрел глобальное значение и стал стандартным методом в различных аспектах для выявления потенциальных целей в клеточных механизмах, для профилирования путей и на молекулярном уровне 8,9. Концепция синтетической летальности включает в себя взаимодействие между двумя генами, где возмущение любого гена само по себе является жизнеспособным, но обоих генов одновременно приводит к потере жизнеспособности10. Использование синтетической летальности при лечении рака может помочь идентифицировать и механически охарактеризовать надежные синтетические летальные генетические взаимодействия11. Мы приняли комбинаторный подход высокопроизводительного скрининга шРНК с синтетической летальностью для выявления эпигенетических факторов, ответственных за приобретенную резистентность к цитарабину при ОМЛ.
Известно, что острые лейкозы, вызванные хромосомной транслокацией гена лейкемии смешанной линии (MLL или KMT2A), связаны с плохой выживаемостью у пациентов. Полученные химерные продукты перегруппировок генов MLL , то есть белки слияния MLL (MLL-FPs), могут трансформировать гемопоэтические стволовые /прогениторные клетки (HSPCs) в лейкемические бласты с участием нескольких эпигенетических факторов. Эти эпигенетические регуляторы представляют собой сложную сеть, которая диктует поддержание программы лейкемии и, следовательно, может формировать потенциальные терапевтические мишени. В этом контексте мы использовали клеточную линию MV4-11 (содержащую ген слияния MLL MLL-AF4 с мутацией FLT3-ITD; называемую MV4-11 P) для разработки приобретенной резистентной к цитарабину клеточной линии, называемой MV4-11 AraC R. Клеточная линия подвергалась воздействию увеличивающихся доз цитарабина с прерывистым восстановлением после медикаментозного лечения, известного как отпуск лекарств. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC50) оценивали с помощью анализа цитотоксичности in vitro .
Мы использовали объединенную эпигенетическую библиотеку шРНК (см. Таблицу материалов), управляемую промотором hEF1a с лентивирусной основой pZIP. Эта библиотека содержит шРНК, нацеленные на 407 эпигенетических факторов. Каждый фактор имеет 5-24 шРНК, в общей сложности 5 485 шРНК, включая пять нецелевых контрольных шРНК. Модифицированный каркас miR-30 "UltrmiR" оптимизирован для эффективного первичного биогенеза и экспрессии шРНК12,13.
Схема этого эксперимента проиллюстрирована на рисунке 1А. Текущий протокол фокусируется на скрининге РНКи с использованием библиотеки шРНК эпигенетического фактора в клеточной линии MV4-11 AraC R (рисунок 1B), клеточной линии суспензии. Этот протокол может быть использован для скрининга любой целевой библиотеки в любой лекарственно-устойчивой клеточной линии по своему выбору. Следует отметить, что протокол трансдукции будет отличаться для адгезивных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следуйте руководящим принципам Институционального комитета по биобезопасности (МЧК) и используйте надлежащий механизм для лечения лентивируса (BSL-2). Персонал должен быть надлежащим образом обучен обращению с лентивирусом и его удалению. Этот протокол следует руководящим принципам биобезопасности Христианского медицинского колледжа в Веллоре.
1. Выбор наиболее мощного промотора для получения стойкой и длительной экспрессии шРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно провести эксперимент по трансдукции с использованием лентивирусных векторов с различными промоторами, которые экспрессируют флуоресцентные белки, чтобы идентифицировать промотор, который обеспечивает стабильную и долгосрочную экспрессию шРНК в клеточной линии, выбранной для эксперимента. Наиболее часто используемыми промоторами для этой цели являются hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и промоторы SSFV (селезеночный фокус-образующий вирус), которые экспрессируют белок зеленой флуоресценции (GFP) (рисунок 2A).
- Выполните подсчет ячеек с помощью метода исключения синего цвета trypan. Суспендировать клетки MV4-11 AraC R в 10% rpmI среде (RPMI с 10% FBS, дополненной 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина), содержащей 8 мкг/мл полибрена. Семена 1 х 106 клеток в 1,5 мл среды/лунки шестилуночной пластины в трех экземплярах.
- Добавляйте различные объемы концентрированных лентивирусов (например, 10 мкл, 20 мкл и 40 мкл в зависимости от титра лентивирусов) в каждую лунку. Аккуратно покрутите тарелку, чтобы перемешать содержимое.
- Выполняют спинфекцию центрифугированием при 920 х г при 37 °C в течение 90 мин.
- Немедленно инкубируйте пластины в инкубаторе CO2 (5% CO2 при 37 °C).
- Наблюдайте экспрессию GFP через 48 ч под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить успешную трансдукцию.
- Количественная оценка экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии через 72 ч для оценки эффективности трансдукции.
- Культивируйте клетки в течение в общей сложности 2 недель и периодически контролируйте экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. Снижение экспрессии GFP, измеренное средней интенсивностью флуоресценции и процентом клеток GFP+, указывает на глушение промотора.
- Отсортируйте клетки GFP+ на 10-й день и культивируйте клетки в течение 1 недели после сортировки. Периодически проверяйте выражение GFP во время изучения языка и региональных параметров.
- Используйте непереведенные ячейки для установки ворот. Популяция за пределами шкалы 1 x10 1 справа по оси X считается положительной популяцией для GFP.
- Выберите промотор, который показывает стойкую экспрессию GFP в пролонгированной культуре клеток.
2. Подготовка объединенной лентивирусной библиотеки шРНК эпигенетического фактора человека
- Культивируйте клетки 293T (при низком количестве проходов с хорошей скоростью пролиферации) в трех чашках для культивирования клеток по 10 см с 8 мл 10% среды DMEM (DMEM с 10% FBS, содержащим 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина) в каждой пластине.
- Как только клетки достигнут 60% слияния, замените среду полной средой.
- Приготовьте трансфекционную смесь (как указано в таблице 1), которая содержит безсывороточную среду, лентивирусную упаковку (psPAX2) и плазмиду оболочки (pMD2.G), объединенные библиотечные плазмиды и, наконец, трансфекционный реагент.
- Смажьте смесь, чтобы хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавьте трансфекционную смесь в ячейки 293T и аккуратно перемешайте, закручивая пластины. Инкубируйте пластины в инкубаторе CO2 (5% CO2 при 37 °C). Измените среду через 24 ч.
- Через 48 ч проверьте экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить высокую эффективность трансфекции в клетках 293T.
- Соберите супернатанты вируса через 48 ч, 60 ч и 72 ч и храните их при 4 °C. Добавляйте свежую среду (8 мл) в каждый момент времени после сбора вируса.
- Объедините вирусные супернатанты. Общий объем объединенных вирусов составит: ~8 мл/пластина x 3 коллекции= ~24 мл/пластина; ~24 мл/пластина x 3 пластины = ~72 мл из 3 пластин.
- Фильтруйте объединенные вирусы с помощью фильтра 0,4 мкм.
- Для получения высокого титра вирусов концентрируют объединенные вирусы методом ультрацентрифугирования. Перенесите отфильтрованный вирусный супернатант в две трубки 70 Ti (32 мл/пробирка) и центрифугу при 18 000x g в течение 2 ч с медленным ускорением и замедлением. Используйте ротор и центрифугу с предварительным охлаждением до 4 °C.
- Осторожно выньте трубки из центрифуги и полностью удалите супернатант.
- Используя микропипетку, аккуратно повторно суспендируйте гранулу в 400 мкл DMEM (без FBS и антибиотиков). Инкубировать на льду в течение 1 ч и перемешать гранулы из обеих трубок.
- Аликвотирует вирусы и замораживается при −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки и вирусы должны храниться на льду во время этапов 2.10.-2.13. Избегайте вспенивания при повторном использовании вируса с помощью простой среды. Среда должна поддерживаться при температуре 4 °C. - Рассчитайте концентрацию (x) вируса следующим образом:
Общий объем до концентрации = 72 мл (72 000 мкл)
Объем после концентрирования = 400 мкл
Концентрация = 72 000/400= 180x
3. Оценка эффективности трансдукции лентивирусов
- Трансдуцировать клетки 293Т с концентрированным вирусом в разных объемах (2 мкл, 4 мкл, 8 мкл) для подтверждения успешного получения лентивирусов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрированные вирусы показывают высокую эффективность трансдукции (>50%) в небольших объемах (1-2 мкл), целесообразно разбавить концентрированный вирус в желаемых количествах (от 100x до 75x). - Разбавляют концентрированный вирус до 100x DMEM (без FBS и антибиотиков) для проведения экспериментов по титрованию в клеточной линии MV4-11 AraC R.
- Семена 1 х 106 ячеек (клеточная линия MV4-11 AraC R в 1,5 мл 10% среды RPMI, содержащей 8 мкг/мл полибрена) в одной лунке шестилуночной пластины. Подготовьте четыре скважины для обработки различными объемами вирусов.
- Добавьте четыре различных объема (например, 1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл) 100x вирусов.
- Выполняют спинфекцию путем центрифугирования пластины при 920 х г в течение 90 мин при 37 °C.
- Через 72 ч измеряют процентное содержание клеток GFP+ методом проточной цитометрии.
- Определить объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции. Эта низкая эффективность трансдукции обеспечивает интеграцию одной шРНК на клетку.
4. Трансдукция объединенной эпигенетической библиотеки шРНК в лекарственно-устойчивую клеточную линию
- Поддерживайте линию клеток-мишеней MV4-11 AraC R при плотности 0,5 x 106 клеток/мл. Убедитесь, что клетки находятся в фазе экспоненциального роста в культуре.
- Рассчитайте количество клеток, которые будут взяты для эксперимента, как показано ниже, исходя из количества вирусных интегрантов.
Количество клеток, необходимых для трансдукции = 5,485 (количество шРНК) × 500 (представление сложенной шРНК) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~11 x 106 клеток - Повторное суспендирование 1,1 х 107 ячеек в 16 мл 10% RPMI среды.
- Добавьте полибрен (8 мкг/мл) и хорошо перемешайте. Затем добавьте необходимый объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции, как рассчитано в предыдущем разделе.
- Посейте все ячейки на шестилуночной пластине с плотностью 1 х 106 клеток/1,5 мл 10% rpmI среды на лунку.
- Центрифугировать пластину в течение 90 мин при 920 х г при 37 °C.
- Инкубируйте пластину на ночь в инкубаторе CO2 (5% CO2 при 37 °C).
- Через 24 ч изменяют среду и переносят трансдуцированные клетки в колбу Т-75.
- Через 48 часов проверьте GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить успешную трансдукцию.
- Через 72 ч количественно оцените процентное содержание клеток GFP+ с помощью проточной цитометрии.
5. Обогащение GFP-положительных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Расширение трансдуцированных клеток путем культивирования их при плотности 0,5 х 106 клеток/мл в течение 5-7 дней. Эти клетки представляют собой смешанную популяцию трансдуцированных и нетрансдуцированных, отобранных на основе GFP путем сортировки, как упоминалось на следующем этапе.
- Выполните проточную сортировку трансдуцированных ячеек GFP+ с настройками сортировки потока, заданными как высокая чистота и низкий выход. Используйте непереведенные ячейки для установки ворот. Популяция за пределами 1 х 102 вправо считается положительной популяцией.
- Соберите отсортированные клетки в 5% RPMI (RPMI с 5% FBS с добавлением 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина).
- Культивируйте отсортированные клетки в 10% RPMI среде.
- Через 72 ч выполните постсортировочную оценку процента ячеек GFP+, чтобы обеспечить эффективность сортировки >95%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что после сортировки получено ~3-5 x 106 GFP положительных клеток, чтобы получить представление библиотеки шРНК от 450x до ~500x.
6. Скрининг отсева для выявления эпигенетических факторов, опосредующих лекарственную устойчивость
- Культивируйте библиотеку шРНК трансдуцированных клеток в 10% RPMI в течение 5 дней. Криоконсервировать трансдуцированные клетки для будущих экспериментов, если это необходимо, перед медикаментозным лечением.
- Центрифуга 1 х 107 ячеек в дубликатах по 280 х г в течение 5 мин при 25 °С. Выбросьте супернатант и храните гранулы при температуре −80 °C. Эти образцы будут служить базовым ориентиром для эпигенетической библиотеки шРНК.
- Культивируйте оставшиеся трансдуцированные клетки как дубликаты (R1 и R2), каждая из которых поддерживается при количестве клеток, которое обеспечивает 500-кратное представление библиотеки.
- Обработать один из дубликатов препаратом (10 мкМ цитарабина) (R2), а другой без медикаментозного лечения (R1).
- Меняйте среду для колб с препаратом и без него каждые 72 ч. Повторите изменение среды 3 раза при кумулятивном воздействии препарата в течение 9 дней.
- После 9 дней лечения препаратом проверьте жизнеспособность клеток методом исключения трипан-синего цвета.
- Центрифугировать оставшиеся ячейки при 280 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в стерильном PBS и промывайте клетки. Центрифуга при 280 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Выбросьте супернатант и храните гранулы при температуре −80 °C для экстракции ДНК.
7. Амплификация интегрированных шРНК методом ПЦР
- Экстракция ДНК из трансдуцированных базовых клеток (Т) (стадия 6.2.) и клеток, обработанных препаратом (R2) и необработанных препаратом (R1).
- Проверьте концентрацию образца с помощью флуорометра.
- Рассчитайте количество ДНК, необходимое для ПЦР, как показано ниже:
5 485 (нет. шРНК) × 500 (представление шРНК) × 1 х 6,6−12 (г/диплоидный геном) = 15 мкг ДНК - Подвергайте образцы первому раунду ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционная смесь ПЦР изображена в таблице 2 с условиями термоциклера. Подробная информация о грунтовках приведена в дополнительной таблице 1. - Настройте несколько реакций, содержащих 850 нг ДНК на трубку (в общей сложности 43 реакции).
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый раунд ПЦР усиливает фланговые области шРНК, в результате чего размер ампликона составляет 397 bp. - Объедините продукты ПЦР и очистите продукты ПЦР, используя 3-4 колонки стандартного набора для очистки геля / ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация приводится в таблице 3. - Элюируют продукт в 50 мкл буфера из каждой колонки и объединяют элюты.
- Количественно оцените ДНК и сохраните ее при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты сведены в таблицу 4 с условиями термоциклера. Вторая ПЦР использует праймеры с последовательностью INDEX, необходимой для мультиплексирования в NGS в однопоточной клетке. Таким образом, каждый образец должен быть помечен другим индексом. Последовательности праймеров приведены в дополнительной таблице 1. - Настройте четыре реакции с 500 нг первичного продукта ПЦР в общем объеме реакции 50 мкл для каждого образца и отрицательного контроля.
- Загрузите весь продукт для электрофореза с использованием 2% агарозного геля TBE и подтвердите размер полосы с помощью молекулярной лестницы 1 кб. Размер ампликона составляет 399 bp.
- Визуализируйте продукты ПЦР в системе документации на гель.
- Иссейте определенную полосу и очистите с помощью набора для очистки геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты по очистке с помощью комплекта приведены в таблице 3. - Элюют в конечном объеме 30 мкл буфера элюирования. Приблизительная концентрация каждого элюента составит около 80-90 нг/мкл при общем объеме 30 мкл.
8. Секвенирование и анализ данных нового поколения
- Последовательное введение продукта, очищенного гелем, начиная со стадии 7.13. на секвенсоре следующего поколения (например, Illumina) для получения счетчика считывания для истощенных шРНК.
- Обрежьте последовательности адаптеров сгенерированных считываний FastQ с помощью набора инструментов Fastx (версия 0.7).
- Выровняйте отфильтрованные чтения по ссылочным последовательностям с помощью элайнера Bowtie с параметром допуска двух несоответствий. Убедитесь, что длина чтения после обрезки адаптера составляет около 21 бит/с.
- Загрузите файлы с помощью программы Samtools (версия 1.9). Используйте параметр Flagstat и вычислите сводку выравнивания.
- Загрузите обрезанные файлы fastQ в программное обеспечение CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) вместе с эталонными последовательностями shRNA в виде файлов FASTA и выполните анализ в соответствии с инструкциями.
- Нажмите на ссылку Начать анализ в CC2.
- Выберите тип экрана Как Экран Выживание и Выпадение. Задайте количество групп и введите имя каждой группы.
- Загрузите справочную библиотеку в формате файла FASTA. Загруженные данные обрабатываются. Нажмите на выходной URL-адрес, чтобы получить результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение использует бета-биномиальную модель с модифицированным t-тестом Стьюдента для измерения различий в уровнях сгРНК/шРНК, за которым следует комбинированный вероятностный тест Фишера для оценки значимости на уровне генов. Он вычисляет оценочные общие логарифмические 2-кратные изменения (Log2Fc) шРНК для эпигенетических факторов между обработанными (обогащенными/истощенными) и необработанными образцами (исходными линиями) с «p-значениями» и «значениями FDR».
- Убедитесь, что значение FDR является «Отрицательным» для экрана выпадения и «Положительным» для экрана выживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: CC2 является аналитической платформой для подсчета показаний и расчета представления складки (обогащения или истощения) шРНК между образцами. - Определите значительно обогащенные и истощенные шРНК (FDR <0,05) из результатов CC2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 5-24 шРНК против каждого фактора. Проверьте значения FDR для каждой из шРНК; рассмотрим FDR, который составляет <0,01, и возьмем среднее значение для выбранных ШРНК. Рассмотрим топ-40 хитов. Построение графика для выбранных факторов на основе отрицательных значений Log2Fc или FDR. Убедитесь, что нецелевые шРНК также имеют значительные значения FDR, чтобы обеспечить подлинность данных, поскольку они служат контрольными шРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий рабочий процесс скрининга показан на рисунке 1A. In vitro цитотоксичность MV4-11 AraC R (48 ч) показала, что IC50 к цитарабину в MV4-11 AraC R выше, чем MV4-11 P (рисунок 1B). Эта клеточная линия была использована в исследовании в качестве модели для скрининга эпигенетических факторов, ответственных за резистентность к цитарабину.
На рисунке 2A показаны линеаризованные векторные карты pZIP с тремя различными промоторами: hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и SSFV (вирус, формирующий фокус селезенки), с скремблированной шРНК в последовательности UltramiR. Рисунок 2B иллюстрирует векторную карту pZIP, используемую в библиотечном эксперименте, и шРНК, нацеленную на эпигенетический фактор с Zsgreen и пуромицином в качестве выбираемого маркера, управляемого промотором hEF1a. Эти векторы были использованы при выборе наиболее мощного промоторного эксперимента.
Выбор наиболее мощного промотора для получения последовательной и длительной экспрессии в клетках-мишенях проиллюстрирован на рисунке 3. Количественная оценка GFP, измеренная MFI, показала более 90% эффективности трансдукции в конце 72 ч в MV4-11 AraC R для всех трех промоутеров. Гистограмма экспрессии GFP показывает гетерогенную популяцию для hCMV, но однородную в случае hEF1a и SFFV на 3-й день трансдукции (рисунок 3A). Гистограмма показывает экспрессию GFP, управляемую тремя различными промоторами (hEF1α, hCMV и SFFV) на 3-й день трансдукции в MV4-11 AraC R (рисунок 3B). GFP, управляемый SFFV, показал снижение MFI на 5-й день трансдукции (рисунок 3C). Не наблюдалось снижения MFI при первичной сортировке родительской линии MV4-11, управляемой hEF1a. Таким образом, промотор hEF1a был идентифицирован как подходящий промотор для клеточной линии (рисунок 3D).
Рисунок 4А иллюстрирует эффективность трансфекции объединенных плазмид библиотеки шРНК в клетках 293T после 48 ч трансфекции. Выражение GFP было ярким, что указывает на хорошую эффективность трансфекции. После сбора вируса эффективность трансдукции подготовленного объединенного вируса проверяли в клетках 293T в трех различных концентрациях (2 мкл, 4 мкл и 8 мкл). Мы заметили, что даже вирус 2 мкл приводил к той же эффективности, что и вирус 8 мкл, тем самым подтверждая высокий вирусный титр (рисунок 4B).
На рисунке 5 показана трансдукция объединенной библиотеки в клеточной линии MV4-11 AraC R и определение лентивирусного титра. Объединенную библиотеку шРНК лентивирус разбавляли в 100 раз, а затем добавляли к клеточной линии MV4-11 AraC R в разных объемах (1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл). Эффективность была проверена в конце 72 ч. Эффективность трансдукции составила 30% для 2-2,5 мкл вируса, подтверждая одну интеграцию шРНК на клетку (рисунок 5А). Трансдукция с 2,5 мкл объединенного библиотечного вируса в ячейках 1,1 x 107 MV4-11 AraC R привела к эффективности трансдукции 30%. GFP-положительные клетки были отсортированы, представляя собой объединенную библиотеку шРНК (рисунок 5B).
После трансдукции объединенного шРНК эпигенетического лентивируса в клеточной линии MV4-11 AraC R GFP-положительные клетки сортировали на 5-й день или 7-й день (рисунок 6). Эти отсортированные клетки подвергались длительному воздействию цитарабина в течение 9 дней. Жизнеспособность была проверена на 9-й день, и клетки были собраны для ДНК. (Рисунок 6А). Гистограмма показывает снижение скорости пролиферации трансдуцированных клеток в присутствии цитарабина (рисунок 6B).
Извлеченную ДНК из образцов подвергали двум раундам ПЦР, а конечный гель-элюированный продукт представлял собой обогащенные шРНК, количественно оцененные NGS. На рисунке 7А показаны области связывания праймера, используемого в 1-м и 2-м раундах ПЦР, где праймеры 1-го раунда связываются с фланговыми областями интегрированной шРНК, а 2-й прямой праймер связывается с петлевой последовательностью. Обратный праймер связывается с областью амплифицированного вектора в 1-м раунде ПЦР. Рисунки 7B и 7C иллюстрируют размер полосы продукта ПЦР в конце 1-го (397 bp) и 2-го раунда ПЦР (399 bp), который был элюирован гелем, очищен и представлен для анализа NGS.
После подвергнутия ДНК стандартной процедуре контроля качества образцы были обработаны для анализа NGS. Мы использовали CRISPRCloud2, удобную для пользователя облачную аналитическую платформу для выявления обогащенных и истощенных шРНК в объединенном скрининге шРНК. Рисунок 8 иллюстрирует представление обогащенных или истощенных шРНК, нацеленных на эпигенетические факторы, которые могут опосредуть резистентность к цитарабину при ОМЛ.
Рисунок 1: Схема и модель исследования. (A) Иллюстрация обзора рабочего процесса. (B) MV4-11 родительские и AraC-резистентные клетки, обработанные повышением концентрации цитарабина (от 0,1 мкМ до 1000 мкМ) и жизнеспособность, оцененные с помощью анализа МТТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Иллюстрация линеаризованных векторов. (A) Три векторные карты с тремя различными промоторами, hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и SSFV (вирус, формирующий фокус селезенки), с скремблированной шРНК в последовательности UltramiR. (B) Иллюстрация векторной карты, используемой в библиотечном эксперименте с промотором hEF1α и шРНК, нацеленной на эпигенетический фактор с Zsgreen и пуромицином в качестве выбираемого маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Выбор наиболее мощного промотора для получения стойкой и пролонгированной экспрессии шРНК. (A) Репрезентативные графики потока для GFP, количественно оцененные проточной цитометрией в конце 72 ч для промоторов hEF1a, hCMV и SFFV. hCMV показывает гетерогенный пик, в то время как hEF1a и SFFV показывают один однородный пик. (B) Эффективность промотора в клеточной линии MV4-11 AraC R. (C) GFP, управляемый SFFV, показывает замалчивание GFP в длительной культуре. (D) клетки GFP, управляемые hEF1a, демонстрируют устойчивую экспрессию после сортировки клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проверка эффективности подготовленного объединенного лентивируса шРНК. (А) Изображения флуоресцентной микроскопии показывают эффективность трансфекции объединенной библиотеки шРНК, трансфектированной в 293Т в конце 48 ч с использованием 10-кратного увеличения. (B) Эффективность трансдукции объединенного вируса оценивали в 293T-клетках с различными объемами вируса (2 мкл, 4 мкл и 8 мкл) с использованием 10-кратного увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Объединенная библиотечная трансдукция в клеточной линии-мишени и определение лентивирусного титра. (A) Клеточная линия MV4-11 AraC R трансдуцируется с различными объемами вируса (1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл). Эффективность проверяли в конце 72 ч. (B) Трансдукция объединенного библиотечного вируса в 1 x 107 MV4-11 AraC R клеток для достижения 30% эффективности трансдукции, затем сортировка GFP-положительных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Скрининг выпадения для выявления эпигенетических факторов, опосредующих лекарственную устойчивость. (А) Схематическая иллюстрация лекарственного лечения для обогащения резистентных клеток. Зараженные библиотекой клетки подвергались длительному воздействию цитарабина в течение 9 дней с последующей проверкой жизнеспособности и сбором клеток для извлечения ДНК. (B) Снижение жизнеспособности длительного воздействия цитарабина в резистентных клеточных линиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Получение ампликонов, представляющих интегральную шРНК. (А) Области связывания праймера, используемые в 1-м и 2-м раунде ПЦР, где праймеры 1-го раунда связываются с фланговыми областями интегрированной шРНК, а второй передний праймер связывается с петлевой последовательностью. Обратный связывается с областью амплифицированной векторной области в 1-й ПЦР. (B) Иллюстрация размера полосы продукта ПЦР в конце 1-го раунда ПЦР (397 bp). (C) ПЦР-продукт 2-го раунда (399bp) был элюирован гелем, очищен и введен для NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Результаты скрининга в клеточной линии AML (клеточная линия MV-4-11 Ara-C R). После подвергнутия ДНК стандартной процедуре контроля качества образцы были обработаны для анализа NGS. Мы использовали CRISPRCloud2, удобную для пользователя облачную аналитическую платформу, для выявления обогащенных и истощенных шРНК в объединенном скрининге шРНК. Рисунок представляет собой обогащенные или истощенные шРНК, нацеленные на эпигенетические факторы, которые могут опосредуть резистентность к цитарабину при ОМЛ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Приготовление трансфекционной плазмидной смеси (расчет для 10 см пластины) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Реакционная смесь ПЦР для1-го раунда ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Расчеты по очистке продуктов 1-й ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Реакционная смесь ПЦР для 2-го раунда ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РНК-интерференция (РНКи) широко используется для исследований функциональной геномики, которые включают скрининг siRNA и шРНК. Преимущество шРНК заключается в том, что они могут быть включены в плазмидные векторы и интегрированы в геномную ДНК, что приводит к стабильной экспрессии и, таким образом, более длительному нокдауну целевой мРНК. Объединенный скрининг библиотеки шРНК является надежным и экономически эффективным по сравнению с обычными массивными экранами (siRNA). Определение существенности определенного класса белков на общегеномном экране может быть громоздким. Целевые подходы к скринингу могут выявить важность отдельных белков для выживания раковых клеток или лекарственной устойчивости в пределах определенного класса с пониженным шумом. Этот протокол подчеркивает скрининг РНКи эпигенетических факторов для систематического опроса как существенных, так и несущественных генов, и демонстрирует использование этого подхода в качестве функциональной платформы, позволяющей идентифицировать мишени, ответственные за лекарственную устойчивость к ОМЛ.
Эта мощная технология требует определенных мер предосторожности при разработке и выполнении экспериментов. Во-первых, это выбор промоторов, которые не подвергаются значительному глушению во время клеточной культуры для экспрессии шРНК, поскольку их надежная экспрессия имеет решающее значение для сбивания генов-мишеней. Во-вторых, особое значение имеет поддержание представления шРНК (количество клеток, трансдуцированных с каждой шРНК). На протяжении всего экрана шРНК среднее представление >500 клеток на конструкцию шРНК увеличивает потенциал для идентификации шРНК, которые вызывают фенотипические эффекты.
Стратегия скрининга РНКи является конкурентным экраном роста; поэтому крайне важно убедиться, что клетки-мишени находятся в логарифмической фазе роста и не сливаются во время экрана, чтобы свести к минимуму потерю представления, вызванную ограниченным ростом. Идеально поддерживать клетки на уровне 50%-70% слияния, чтобы свести к минимуму экспериментальные вариации. Мы рекомендуем поддерживать постоянное количество сред, сывороток, вирусных супернатантов, лекарств и пластических культур тканей для всех реплик экрана, чтобы уменьшить экспериментальные вариации.
Целесообразно проведение пилотных экспериментов по оптимизации эффективности трансдукции лентивируса для расчета объема вирусов, необходимого для достижения одной интеграции шРНК на клетку. Чтобы достичь этой интеграции одной шРНК на клетку, эффективность трансдукции должна быть менее 30%. Поскольку количество вирусов для получения 30% трансдуцированных клеток может варьироваться между клеточными линиями, используемыми для экспериментов, требуется эксперимент по стандартизации для каждой клеточной линии. Эффективность трансдукции также может зависеть от условий клеточной культуры и скорости пролиферации клеток. Следовательно, функциональные титры должны быть определены в пилотном эксперименте с использованием тех же условий, которые использовались в скрининговом эксперименте. Поддержание 3-6 реплик всегда целесообразно для получения статистически значимых попаданий.
Двумя основными проблемами подхода к скринингу шРНК являются нецелевые эффекты и переменная эффективность нокдауна шРНК16. Их можно преодолеть, используя несколько шРНК каждого гена. Адаптация прокариотической иммунной системы CRISPR-Cas9 в клетках млекопитающих позволила легко, эффективно и экономично редактировать геном в культивируемых клетках человека. Эта система широко использовалась для выполнения общегеномных генетических скринингов, аналогичных тем, которые проводятся с использованием шРНК. Судьба клеток, содержащих определенную последовательность однонаправленной РНК (sgRNA), может контролироваться с помощью глубокого секвенирования. Экспериментальная установка, описанная здесь, также может быть использована для скрининга CRISPR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов и нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование частично финансируется за счет гранта Департамента биотехнологии BT/PR8742/AGR/36/773/2013 для SRV; и Департамент биотехнологии Индии BT/COE/34/SP13432/2015 и Департамент науки и техники, Индия: EMR/2017/003880 до P.B. RVS и P.B. поддерживаются Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 и IA/S/15/1/501842, соответственно. S.D. поддерживается стипендией CSIR-UGC, а S.I. поддерживается старшей исследовательской стипендией ICMR. Мы благодарим Абхирупа Багчи, Сандию Рани и сотрудников CSCR Flow Cytometry Core Facility за их помощь. Мы также благодарим MedGenome Inc. за помощь в высокопроизводительном секвенировании и анализе данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
