الكشف عن سلالة Wolbachia wAlbB في خطوط خلايا الزاعجة البيضاء
Summary
تم استخدام أربع طرق للكشف عن Wolbachia داخل الخلايا ، والتي تكمل بعضها البعض وتحسن دقة الكشف عن عدوى Wolbachia من الزاعجة المشتقة من Aedes albopictus Aa23 و Aa23-T التي تم علاجها من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية.
Abstract
باعتبارها تكافلا داخليا مؤمنا للأمهات ، تصيب Wolbachia نسبا كبيرة من مجموعات الحشرات. وقد أفادت الدراسات مؤخرا عن التنظيم الناجح لانتقال فيروس الحمض النووي الريبي باستخدام البعوض المنقول من ولبخيا. وتشمل الاستراتيجيات الرئيسية للسيطرة على الفيروسات التلاعب بتكاثر المضيف عن طريق عدم التوافق السيتوبلازمي وتثبيط النسخ الفيروسية عن طريق التحضير المناعي والتنافس على الموارد المشتقة من المضيف. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية لاستجابات البعوض المنقول من Wolbachia للعدوى الفيروسية غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتعرف في المختبر على عدوى الولبخية على مستويات الحمض النووي والبروتين في خلايا الزاعجة البيضاء (Diptera: Culicidae) Aa23 لتعزيز فهم التفاعلات بين Wolbachia وناقلات الحشرات الخاصة بها. من خلال الاستخدام المشترك لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و PCR الكمي ، واللطخة الغربية ، والطرق التحليلية المناعية ، تم وصف بروتوكول مورفولوجي قياسي للكشف عن الخلايا المصابة ب Wolbachia وهو أكثر دقة من استخدام طريقة واحدة. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج للكشف عن عدوى Wolbachia في أنواع الحشرات الأخرى.
Introduction
بعوضة النمر الآسيوي Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) ، وهي ناقل رئيسي لفيروس حمى الضنك (DENV) في آسيا وأجزاء أخرى من العالم1 ، هي مضيف طبيعي لنوعين من البكتيريا داخل الخلايا ، Wolbachia (w AlbA و wAlbB) ، والتي يتم توزيعها في جميع أنحاء الخط الجرثومي والأنسجة الجسدية 2,3. يتكون خط خلايا Aa23 المشتق من أجنة A. albopictus من نوعين على الأقل من الخلايا المورفولوجية ، وكلاهما يدعم العدوى4 ويمكن علاجه من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية (Aa23-T). بالنظر إلى أن Aa23 يحتفظ فقط ب wAlbB ، فهو نموذج مفيد لدراسة التفاعلات بين المضيف والتكافلالداخلي 4,5,6.
ينتقل Wolbachia عن طريق الأم ويصيب ما يقدر بنحو 65٪ من أنواع الحشرات 8,9 و 28٪ من أنواع البعوض10. يصيب مجموعة متنوعة من الأنسجة ويشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيف ، وعادة ما يؤدي إلى عدم توافق السيتوبلازم (CI)11 واستبدال السكان عن طريق التلاعب بالجهاز التناسلي المضيف12,13. وقد لوحظت هذه الاستجابات المضيفة في المجموعات الطبيعية من ذبابة الفاكهة simulans14 وفي A. aegypti في قفص مختبري وتجربة ميدانية15. هناك تلاعب مهم غير إنجابي أثارته Wolbachia وهو مقاومة المضيف لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك DENV وفيروس Chikungunya (CHIKV) وفيروس غرب النيل (WNV) 16,17 ، والتي يمكن أن يتوسط فيها نظام المناعة الفطري المحسن للتكافل18,19 ، والمنافسة بين Wolbachia والفيروسات على الموارد المضيفة الأساسية20 ، والتلاعب بمسارات الدفاع الفيروسي المضيف21 .
تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة هذه الآليات الأساسية للاستجابات المضادة للفيروسات المضيفة التي يسببها Wolbachia. ويستخدم أربع طرق للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا من خلايا Aa23. توفر هذه الطرق أساسا نظريا قويا لدراسات عدوى Wolbachia داخل الخلايا للأنواع المضيفة الأخرى. الطريقة الأولى ، PCR – وهي تقنية قوية تسمح بالتضخيم الأنزيمي لمناطق محددة من الحمض النووي دون استخدام إجراءات الاستنساخ التقليدية – تم استخدامها للكشف عن الحمض النووي Wolbachia وتحديد وجود / عدم وجود عدوى Wolbachia 22. تقيس الطريقة الثانية كثافة نسخ الحمض النووي Wolbachia باستخدام PCR الكمي (qPCR) للكشف والقياس الموثوق للمنتجات التي تم إنشاؤها خلال كل دورة PCR والتي تتناسب طرديا مع كمية القالب قبل PCR23. تكتشف الطريقة الثالثة وجود بروتينات Wolbachia داخل الخلايا ، باستخدام اللطخة الغربية – واحدة من أقوى الأدوات للكشف عن بروتينات محددة في مخاليط معقدة من خلال الجمع بين قوة الفصل العالية للرحلان الكهربائي ، وخصوصية الأجسام المضادة ، وحساسية التفاعلات الأنزيمية اللونية. الطريقة النهائية هي اختبار التألق المناعي (IFA) الذي يجمع بين علم المناعة والكيمياء الحيوية والفحص المجهري للكشف عن بروتين سطح Wolbachia (wsp) من خلال تفاعل الأجسام المضادة المستضدية لتأكيد الامتصاص الخلوي ل Wolbachia وتحديد توطينه الخلوي.
تصف هذه الورقة الطرق الأربع المذكورة أعلاه للتحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها للكشف عما إذا كان Wolbachia الخارجي قد تم نقله بنجاح وتم مسح Wolbachia في الخلية. بعد تحديد ما إذا كانت Wolbachia موجودة في الخلايا أم لا ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات المختلفة ، بما في ذلك علم الجينوم أو البروتيوميات أو الأيض. يوضح هذا البروتوكول اكتشاف Wolbachia من خلال خلايا Aa23 ولكن يمكن استخدامه أيضا في خلايا أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة التفاعلات بين Wolbachia ومضيف وتأكيد النقل الناجح للخلايا ذات السلالات الجديدة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستويات الحمض النووي والبروتين. هذه الطرق التجريبية الأربع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور شين رو وانغ من جامعة مينيسوتا على اقتراحاته وتوجيهاته الثاقبة. تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
