Summary

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

Published: June 01, 2022
doi:

Summary

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Abstract

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Introduction

El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.

Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .

Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.

Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.

Protocol

1. Materiales y reactivos Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales). Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones. Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes.NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este p…

Representative Results

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando …

Discussion

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las cél…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).

Materials

Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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Cite This Article
Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

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