Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus
Summary
Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l’accuratezza del rilevamento dell’infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall’infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.
Abstract
Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell’ospite attraverso l’incompatibilità citoplasmatica e l’inibizione dei trascritti virali attraverso l’innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall’ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all’infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l’identificazione in vitro dell’infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l’uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell’uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell’infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.
Introduction
La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo1, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico 2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l’infezione4 e possono essere curate dall’infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici (Aa23-T). Dato che Aa23 conserva solo wAlbB, è un modello utile per lo studio delle interazioni ospite-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia è trasmesso per via materna e infetta circa il 65% delle specie di insetti 8,9 e il 28% delle specie di zanzare10. Infetta una varietà di tessuti e forma un’intima relazione simbiotica con l’ospite, di solito inducendo incompatibilità citoplasmatica (CI)11 e sostituzione della popolazione manipolando il sistema riproduttivo dell’ospite12,13. Queste risposte dell’ospite sono state osservate in popolazioni naturali di Drosophila simulans14 e in A. aegypti in una gabbia di laboratorio e in una prova sul campo15. Un’importante manipolazione non riproduttiva suscitata da Wolbachia è la resistenza indotta dell’ospite a una varietà di agenti patogeni, tra cui DENV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus del Nilo occidentale (WNV)16,17, che può essere mediata da un sistema immunitario innato migliorato del simbionte18,19, competizione tra Wolbachia e virus per le risorse essenziali dell’ospite20 e manipolazione delle vie di difesa virale dell’ospite21 .
Questo protocollo è stato sviluppato per studiare questi meccanismi alla base delle risposte antivirali dell’ospite indotte da Wolbachia. Utilizza quattro metodi di rilevamento dell’infezione intracellulare da Wolbachia delle cellule Aa23. Questi metodi forniscono una solida base teorica per gli studi sull’infezione intracellulare da Wolbachia di altre specie ospiti. Il primo metodo, la PCR, una potente tecnica che consente l’amplificazione enzimatica di specifiche regioni del DNA senza utilizzare procedure di clonazione convenzionali, è stato utilizzato per rilevare il DNA di Wolbachia e determinare la presenza / assenza di infezione da Wolbachia 22. Il secondo metodo misura la densità di copia del DNA di Wolbachia utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) per il rilevamento e la misurazione affidabili dei prodotti generati durante ogni ciclo PCR che è direttamente proporzionale alla quantità di modello prima della PCR23. Il terzo metodo rileva la presenza di proteine Wolbachia intracellulari , utilizzando western blot, uno degli strumenti più potenti per rilevare proteine specifiche in miscele complesse combinando l’elevato potere di separazione dell’elettroforesi, la specificità degli anticorpi e la sensibilità delle reazioni enzimatiche cromogeniche. Il metodo finale è un test di immunofluorescenza (IFA) che combina immunologia, biochimica e microscopia per rilevare la proteina di superficie wolbachia (wsp) attraverso una reazione antigene-anticorpo per confermare l’assorbimento cellulare di Wolbachia e determinarne la localizzazione cellulare.
Questo documento descrive i quattro metodi sopra elencati per verificare l’esistenza di Wolbachia nelle cellule, che possono essere utilizzati per rilevare se la Wolbachia esogena è stata trasfetta con successo e la Wolbachia nella cellula è stata eliminata. Dopo aver determinato se Wolbachia è presente nelle cellule o meno, è possibile eseguire una varietà di analisi diverse, tra cui genomica, proteomica o metabolomica. Questo protocollo dimostra il rilevamento di Wolbachia attraverso le cellule Aa23, ma può essere utilizzato anche in altre cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il rilevamento dell’infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l’infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l’accuratezza del rilevamento dell’infezione delle cellule da Wolbachi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Xin-Ru Wang dell’Università del Minnesota per suggerimenti e indicazioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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