Detectando wolbachia strain wAlbb em linhas celulares Aedes albopictus
Summary
Quatro métodos foram usados para detectar wolbachia intracelular, que se complementou e melhorou a precisão de detecção da infecção wolbachia da Aa23 e Aa23-T derivadas de Aa23 e Aa23-T curadas da infecção nativa wolbachia usando antibióticos.
Abstract
Como um endossímbionte abrigado maternamente, Wolbachia infecta grandes proporções de populações de insetos. Estudos relataram recentemente a regulamentação bem sucedida da transmissão do vírus RNA usando mosquitos transfectados por Wolbachia. As principais estratégias para controlar vírus incluem a manipulação da reprodução do hospedeiro por incompatibilidade citoplasmática e a inibição de transcrições virais por meio de priming imunológico e competição por recursos derivados do hospedeiro. No entanto, os mecanismos subjacentes das respostas dos mosquitos transfectados wolbachia à infecção viral são mal compreendidos. Este artigo apresenta um protocolo para a identificação in vitro da infecção por Wolbachia nos níveis nucleicos de ácido e proteína em células Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 para melhorar a compreensão das interações entre Wolbachia e seus vetores de insetos. Através do uso combinado de reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR quantitativo, mancha ocidental e métodos analíticos imunológicos, um protocolo morfológico padrão foi descrito para a detecção de células infectadas por Wolbachia que é mais precisa do que o uso de um único método. Essa abordagem também pode ser aplicada à detecção da infecção por Wolbachia em outras taxas de insetos.
Introduction
O mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que é um vetor chave do vírus da dengue (DENV) na Ásia e em outras partes do mundo1, é um hospedeiro natural de dois tipos de bactérias intracelulares, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), que estão distribuídas por toda a linha germe e tecido somático 2,3. A linha celular Aa23 derivada de embriões A. albopictus consiste em pelo menos dois tipos de células morfológicas, ambos suportam a infecção4 e podem ser curados da infecção nativa da Wolbachia usando antibióticos (Aa23-T). Dado que o Aa23 mantém apenas wAlbB, é um modelo útil para o estudo das interações hospedeira-endossímbionte 4,5,6.
Wolbachia é transmitida maternamente e infecta cerca de 65% das espécies de insetos 8,9 e 28% das espécies demosquitos 10. Infecta uma variedade de tecidos e forma uma relação simbiótica íntima com o hospedeiro, geralmente induzindo incompatibilidade citoplasmática (IC)11 e substituição populacional manipulando o sistema reprodutivohospedeiro 12,13. Essas respostas hospedeiras têm sido observadas em populações naturais de simuladores de Drosophila14 e em A. aegypti em uma gaiola de laboratório e ensaio de campo15. Uma importante manipulação não reproducente provocada pela Wolbachia é induzida resistência hospedeira a uma variedade de patógenos, incluindo DENV, vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (WNV)16,17, que podem ser mediados por um sistema imunológico inato melhorado do simbionte18,19, competição entre Wolbachia e vírus para recursos essenciais de hospedagem20, e manipulação de vias de defesa viralhospedeira 21 .
Este protocolo foi desenvolvido para estudar esses mecanismos subjacentes das respostas antivirais induzidas pela Wolbachia. Utiliza quatro métodos de detecção da infecção por Wolbachia intracelular de células Aa23. Esses métodos fornecem uma forte base teórica para estudos de infecção por Wolbachia intracelular de outras espécies hospedeiras. O primeiro método, PCR-uma técnica poderosa que permite a amplificação enzimática de regiões específicas do DNA sem utilizar procedimentos convencionais de clonagem – foi usado para detectar DNA wolbachia e determinar a presença/ausência da infecção wolbachia 22. O segundo método mede a densidade de cópia de DNA de Wolbachia usando PCR quantitativo (qPCR) para detecção e medição confiável de produtos gerados durante cada ciclo pcr que é diretamente proporcional à quantidade de modelo antes do PCR23. O terceiro método detecta a presença de proteínas wolbachia intracelulares, utilizando uma das ferramentas mais poderosas para detectar proteínas específicas em misturas complexas, combinando o alto poder de separação da eletroforese, a especificidade dos anticorpos e a sensibilidade das reações enzimáticas cromogênicas. O método final é um ensaio de imunofluorescência (IFA) que combina imunologia, bioquímica e microscopia para detectar a proteína da superfície de Wolbachia (wsp) através de uma reação de anticorpos de antígeno para confirmar a absorção celular de Wolbachia e determinar sua localização celular.
Este artigo descreve os quatro métodos listados acima para verificar a existência de Wolbachia nas células, que podem ser usados para detectar se a exógena Wolbachia foi transfeinada com sucesso e a Wolbachia na célula foi limpa. Depois de determinar se wolbachia está presente nas células ou não, uma variedade de diferentes análises podem ser realizadas, incluindo genômica, proteômica ou metabolômica. Este protocolo demonstra a detecção de Wolbachia através de células Aa23, mas também pode ser usado em outras células.
Protocol
Representative Results
Discussion
A detecção da infecção por Wolbachia intracelular é essencial para o estudo das interações wolbachia-hospedeira e a confirmação da transfecção bem sucedida de células com novas cepas. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular nos níveis nucleicos de ácido e proteína. Estes quatro métodos experimentais corroboraram e melhoraram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Xin-Ru Wang, da Universidade de Minnesota, por sugestões e orientações perspicazes. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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