Aedes albopictus 세포주에서 Wolbachia 균주 wAlbB 검출
Summary
네 가지 방법이 세포 내 Wolbachia를 검출하기 위해 사용되었는데, 이는 서로를 보완하고 항생제를 사용하여 네이티브 울바키아 감염의 Aa23 및 Aa23-T가 완치된 Aedes albopictus 유래 Aa23 및 Aa23-T의 Wolbachia 감염의 검출 정확도를 향상시켰다.
Abstract
모성으로 품어진 내생 생물로서 Wolbachia는 곤충 개체군의 많은 부분을 감염시킵니다. 최근 연구에 따르면 울바키아 형질감염된 모기를 이용한 RNA 바이러스 전염의 성공적인 조절이 보고되었다. 바이러스를 조절하기 위한 주요 전략은 세포질 비양립성을 통한 숙주 재생의 조작과 숙주 유래 자원에 대한 면역 프라이밍 및 경쟁을 통한 바이러스 전사체의 억제를 포함한다. 그러나 바이러스 감염에 대한 Wolbachia-transfected 모기의 반응의 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. 이 논문은 울바키아와 그의 곤충 벡터 사이의 상호작용에 대한 이해를 향상시키기 위해 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 세포에서 핵산 및 단백질 수준에서 울바키아 감염의 시험관내 확인을 위한 프로토콜을 제시 한다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR, 웨스턴 블롯 및 면역학적 분석 방법의 조합된 사용을 통해, 단일 방법의 사용보다 더 정확한 울바치아 감염 세포의 검출을 위한 표준 형태학적 프로토콜이 기술되었다. 이 접근법은 또한 다른 곤충 탁사에서 울바키아 감염의 검출에 적용될 수 있다.
Introduction
아시아 호랑이 모기 Aedes albopictus (Skuse) (Diptera : Culicidae)는 아시아 및 세계1의 다른 지역에서 뎅기열 바이러스 (DENV)의 핵심 벡터이며, 생식선과 체세포 조직 2,3에 걸쳐 분포하는 두 가지 유형의 세포 내 박테리아 인 Wolbachia (wAlbA 및 wAlbB)의 자연 숙주입니다. A. 알보픽투스 배아로부터 유래된 Aa23 세포주는 적어도 두 가지 형태학적 세포 유형으로 구성되며, 둘 다 감염4를 지지하고 항생제(Aa23-T)를 사용하여 천연 울바키아 감염을 치료할 수 있다. Aa23이 단지 wAlbB만을 보유한다는 것을 감안할 때, 숙주-endosymbiont 상호작용 4,5,6의 연구에 유용한 모델이다.
울바키아는 모성으로 전염되며 곤충 종 8,9의 약 65 %와 모기 종10의 28 %를 감염시킵니다. 그것은 다양한 조직을 감염시키고 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하며, 일반적으로 숙주 생식 시스템(12,13)을 조작함으로써 세포질 비적합성(CI)11 및 집단 대체를 유도한다. 이러한 숙주 반응은 초파리 시뮬란(14)의 자연 개체군에서, 그리고 실험실 케이지 및 현장 시험(15)에서 A. aegypti에서 관찰되었다. 울바키아에 의해 도출된 중요한 비생식 조작은 DENV, 치쿤구냐 바이러스(CHIKV) 및 웨스트나일 바이러스(WNV)16,17을 포함하는 다양한 병원체에 대한 숙주 내성을 유도하는데, 이는 공생18,19의 개선된 선천적 면역계, 필수 숙주 자원에 대한 울바키아와 바이러스 사이의 경쟁(20), 및 숙주 바이러스 방어 경로의 조작(21)에 의해 매개될 수 있다. .
이 프로토콜은 울바키아-유도된 숙주 항바이러스 반응의 이러한 근본적인 메카니즘을 연구하기 위해 개발되었다. 그것은 Aa23 세포의 세포 내 울바키아 감염의 검출의 네 가지 방법을 사용합니다. 이러한 방법은 다른 숙주 종의 세포 내 울바키아 감염에 대한 연구를위한 강력한 이론적 기반을 제공합니다. 첫 번째 방법은, PCR-종래의 클로닝 절차를 이용하지 않고 DNA의 특정 영역의 효소적 증폭을 허용하는 강력한 기술-울바키아 DNA를 검출하고 울바키아 감염(22)의 존재/부재를 결정하기 위해 사용되었다. 두 번째 방법은 PCR23 이전의 주형의 양에 직접적으로 비례하는 각 PCR 주기 동안 생성된 산물의 신뢰할 수 있는 검출 및 측정을 위해 정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 울바키아 DNA 카피 밀도를 측정한다. 세 번째 방법은 전기 영동의 높은 분리력, 항체의 특이성 및 발색 효소 반응의 민감도를 결합하여 복잡한 혼합물에서 특정 단백질을 검출하는 가장 강력한 도구 중 하나 인 웨스턴 블롯을 사용하여 세포 내 Wolbachia 단백질의 존재를 감지합니다. 최종 방법은 면역학, 생화학 및 현미경을 결합하여 항원 – 항체 반응을 통해 울바키아 표면 단백질 (wsp)을 검출하여 울바키아의 세포 흡수를 확인하고 세포 국소화를 결정하는 면역 형광 분석 (IFA)입니다.
이 논문은 세포에 Wolbachia의 존재를 확인하기 위해 위에 열거 된 네 가지 방법을 설명합니다.이 방법은 외인성 Wolbachia가 성공적으로 형질감염되었고 세포의 Wolbachia가 제거되었는지 여부를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Wolbachia가 세포에 존재하는지 여부를 결정한 후, 유전체학, 프로테오믹스 또는 대사체학을 포함한 다양한 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Aa23 세포를 통한 울바키아의 검출을 보여 주지만 다른 세포에서도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포 내 울바키아 감염의 검출은 울바키아-숙주 상호작용의 연구와 새로운 균주를 가진 세포의 성공적인 형질감염의 확인에 필수적이다. 이 프로토콜에서는 핵산 및 단백질 수준에서 세포 내 울바키아 감염을 성공적으로 검출하기 위해 네 가지 방법이 사용되었습니다. 이 네 가지 실험 방법은 세포의 울바키아 감염의 검출 정확도를 확증하고 개선시켰다.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 통찰력있는 제안과지도에 대한 미네소타 대학의 Xin-Ru Wang 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81760374)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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