Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen
Summary
Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.
Abstract
Als moederlijk gekoesterde endosymbiont infecteert Wolbachia grote delen van de insectenpopulaties. Studies hebben onlangs de succesvolle regulatie van RNA-virusoverdracht gemeld met behulp van Wolbachia-getransfecteerde muggen. Belangrijke strategieën om virussen te beheersen zijn de manipulatie van de reproductie van de gastheer via cytoplasmatische incompatibiliteit en de remming van virale transcripties via immuunpriming en concurrentie voor van de gastheer afgeleide bronnen. De onderliggende mechanismen van de reacties van Wolbachia-getransfecteerde muggen op virale infectie zijn echter slecht begrepen. Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro identificatie van Wolbachia-infectie op het nucleïnezuur- en eiwitgehalte in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-cellen om het begrip van de interacties tussen Wolbachia en zijn insectenvectoren te verbeteren. Door het gecombineerde gebruik van polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve PCR, western blot en immunologische analytische methoden is een standaard morfologisch protocol beschreven voor de detectie van Wolbachia-geïnfecteerde cellen dat nauwkeuriger is dan het gebruik van een enkele methode. Deze aanpak kan ook worden toegepast op de detectie van Wolbachia-infectie in andere insectentaxa.
Introduction
De Aziatische tijgermug Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), een belangrijke vector van het denguevirus (DENV) in Azië en andere delen van de wereld1, is een natuurlijke gastheer van twee soorten intracellulaire bacteriën, Wolbachia (wAlbA en wAlbB), die verspreid zijn over de kiembaan en somatisch weefsel 2,3. De Aa23-cellijn afgeleid van A. albopictus-embryo’s bestaat uit ten minste twee morfologische celtypen, die beide infectie4 ondersteunen en kunnen worden genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica (Aa23-T). Aangezien Aa23 alleen albbbehoudt, is het een bruikbaar model voor de studie van gastheer-endosymbionten interacties 4,5,6.
Wolbachia wordt door de moeder overgedragen en infecteert naar schatting 65% van de insectensoorten 8,9 en 28% van de muggensoorten10. Het infecteert een verscheidenheid aan weefsels en vormt een intieme symbiotische relatie met de gastheer, meestal induceren cytoplasmatische incompatibiliteit (CI)11 en populatievervanging door het manipuleren van het voortplantingssysteem van de gastheer12,13. Deze gastheerresponsen zijn waargenomen in natuurlijke populaties van Drosophila simulans14 en in A. aegypti in een laboratoriumkooi en veldproef15. Een belangrijke niet-productieve manipulatie die door Wolbachia wordt uitgelokt, is geïnduceerde gastheerresistentie tegen een verscheidenheid aan pathogenen, waaronder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) en West-Nijlvirus (WNV)16,17, dat kan worden gemedieerd door een verbeterd aangeboren immuunsysteem van de symbiont18,19, concurrentie tussen Wolbachia en virussen voor essentiële gastheerbronnen20, en manipulatie van gastheer virale verdedigingsroutes21 .
Dit protocol is ontwikkeld voor het bestuderen van deze onderliggende mechanismen van Wolbachia-geïnduceerde gastheer antivirale responsen. Het maakt gebruik van vier methoden voor de detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie van Aa23-cellen. Deze methoden bieden een sterke theoretische basis voor studies van intracellulaire Wolbachia-infectie van andere gastheersoorten. De eerste methode, PCR – een krachtige techniek die de enzymatische amplificatie van specifieke DNA-regio’s mogelijk maakt zonder gebruik te maken van conventionele kloonprocedures – werd gebruikt om Wolbachia-DNA te detecteren en de aanwezigheid / afwezigheid van Wolbachia-infectie te bepalen 22. De tweede methode meet de dichtheid van Wolbachia DNA-kopieën met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) voor betrouwbare detectie en meting van producten die tijdens elke PCR-cyclus worden gegenereerd en die direct evenredig is met de hoeveelheid sjabloon vóór PCR23. De derde methode detecteert de aanwezigheid van intracellulaire Wolbachia-eiwitten , met behulp van western blot – een van de krachtigste hulpmiddelen voor het detecteren van specifieke eiwitten in complexe mengsels door de hoge scheidingskracht van elektroforese, de specificiteit van antilichamen en de gevoeligheid van chromogene enzymatische reacties te combineren. De laatste methode is een immunofluorescentietest (IFA) die immunologie, biochemie en microscopie combineert om het Wolbachia-oppervlakte-eiwit (wsp) te detecteren via een antigeen-antilichaamreactie om de cellulaire opname van Wolbachia te bevestigen en de cellulaire lokalisatie ervan te bepalen.
Dit artikel beschrijft de vier hierboven genoemde methoden om het bestaan van Wolbachia in de cellen te verifiëren, die kunnen worden gebruikt om te detecteren of de exogene Wolbachia met succes is getransfecteerd en de Wolbachia in de cel is gewist. Na het bepalen of Wolbachia al dan niet in de cellen aanwezig is, kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd, waaronder genomics, proteomics of metabolomics. Dit protocol demonstreert de detectie van Wolbachia via Aa23-cellen, maar kan ook in andere cellen worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie is essentieel voor de studie van Wolbachia-gastheerinteracties en de bevestiging van succesvolle transfectie van cellen met nieuwe stammen. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren op het nucleïnezuur- en eiwitniveau. Deze vier experimentele methoden bevestigden en verbeterden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen.
PCR w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Xin-Ru Wang van de Universiteit van Minnesota voor inzichtelijke suggesties en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O’Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
- Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
- O’Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
- Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
- Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
- Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology – Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
- Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
- Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
- Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O’Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
- O’Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. . Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
- Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
- Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
- Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
- Zhang, G., Hussain, M., O’Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
- Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
- Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
- Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
- Zhou, W., Rousset, F., O’Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
- Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
- Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
- Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
- Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).
