Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs
Summary
Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.
Abstract
Viele neuromuskuläre Erkrankungen, wie Myasthenia gravis (MG), sind mit einer Dysfunktion der neuromuskulären Verbindung (NMJ) verbunden, die in Tiermodellen aufgrund physiologischer Unterschiede zwischen Tieren und Menschen schwer zu charakterisieren ist. Tissue Engineering bietet Möglichkeiten, In-vitro-Modelle funktioneller menschlicher NMJs bereitzustellen, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Durch den Einbau optogenetischer Proteine in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugten wir Neuronen, die mit bestimmten Wellenlängen des Lichts stimuliert werden können. Wenn das NMJ gesund und funktionell ist, führt ein neurochemisches Signal des Motoneurons zu einer Muskelkontraktion. Durch die Integration von Optogenetik und Mikrofabrikation mit Tissue Engineering haben wir eine unvoreingenommene und automatisierte Methodik zur Charakterisierung der NMJ-Funktion mittels Videoanalyse etabliert. Es wurde ein standardisiertes Protokoll für die NMJ-Bildung, die optische Stimulation mit gleichzeitiger Videoaufzeichnung und die Videoanalyse der Gewebekontraktilität entwickelt. Die Stimulation optogenetischer Motoneuronen durch Licht zur Induktion von Kontraktionen der Skelettmuskulatur rekapituliert die menschliche NMJ-Physiologie und ermöglicht wiederholte funktionelle Messungen von NMJ im Laufe der Zeit und als Reaktion auf verschiedene Eingaben. Wir demonstrieren die Fähigkeit dieser Plattform, funktionelle Verbesserungen der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit zu zeigen und die schädlichen Auswirkungen von MG-Antikörpern oder Neurotoxinen von Patienten auf die NMJ-Funktion zu charakterisieren.
Introduction
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die chemische Synapse zwischen Motoneuronen (MNs) und Skelettmuskelzellen (SkM), die eine Muskelkontraktion ermöglicht. Toxine wie Neurotoxin α-Bungarotoxin (BTX) oder neuromuskuläre Erkrankungen (NMD) wie Myasthenia gravis (MG) können zu einer Degeneration des NMJ und einer Verringerung der Muskelkontrolleführen 1. Biotechnologisch hergestellte menschliche Gewebemodelle rekapitulieren die funktionellen und physiologischen Mechanismen menschlicher NMJs besser und bieten ein größeres translationales Potenzial als Tiermodelle.
Während Tiermodelle das Verständnis der Bildung und Funktion des NMJ vorangebracht haben, gibt es signifikante Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Synapsen, die die Übersetzung der Ergebnisse auf den Menschen beschränken und die In-vivo-Charakterisierung des NMJ zu einer Herausforderung machen 2,3,4. Studien haben deutliche physiologische Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen NMJs gezeigt. Mäuse haben im Vergleich zu menschlichen NMJs größere NMJs und kleinere aktive Zonendichten4. Darüber hinaus spiegeln Arzneimittelstudien, die in Tiermodellen durchgeführt werden, nicht immer die Wirkungen wider, die in klinischen Studien am Menschen gefunden wurden. Technisch hergestellte menschliche Gewebemodelle bieten die Möglichkeit, die gesunde Entwicklung des NMJ und die Pathologie neuromuskulärer Erkrankungen zu untersuchen und medikamentöse Screenings zu ermöglichen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs)5 können in eine Vielzahl von Zelltypen differenziert werden, einschließlich Skelettmuskelzellen6,7 und Motoneuronen 8,9. hiPS-Zellen können leicht aus Patientenzellen generiert werden, was eine bessere Krankheitsmodellierung 10 und ein Arzneimittelscreening11,12 durch patientenspezifische Gewebemodelle ermöglicht.
Zweidimensionalen (2D) Monolayer-Co-Kulturen von SkMs und MNs fehlen die Morphologie, der Phänotyp, die Organisation und das funktionelle Verhalten physiologischer NMJs. NMJs bilden sich zufällig in einer 2D-Kultur, die die Isolierung motorischer Einheiten für die Analyse hemmt, genaue funktionelle Messungen einschränkt und ihre Verwendung für wiederholte, systematische Experimente verhindert13 . Dreidimensionale (3D) Gewebemodelle von NMJs überwinden viele dieser Einschränkungen und rekapitulieren die morphologischen und funktionellen Eigenschaften physiologischer NMJs 7,14,15,16,17. Unter Verwendung dieses Modells werden die beiden Gewebetypen separat entwickelt und dann integriert, indem das axonale Wachstum gesteuert wird, so dass sich im Vergleich zu 2D-Kultursystemen besser organisierte NMJs entwickeln können.
Unsere frühere Studie zeigte, dass die Kombination von Optogenetik mit Tissue Engineering eine genaue nicht-invasive Stimulation und Bewertung der NMJ-Funktionermöglichen kann 18,19. Durch die Gentechnik können lichtempfindliche Proteine in das Genom von hiPSCs integriert werden. Die Integration von Kanalrhodopsin-2 (ChR2), einem Ionenkanal, der sich als Reaktion auf blaues Licht öffnet, in die Membran erregbarer Zellen wie Neuronen ermöglicht eine berührungslose raumzeitliche Kontrolle über die Zellaktivierung20,21,22. hiPSCs, die ChR2 tragen, können in optogenetische Motoneuronen unterschieden werden, die für blaues Licht empfindlich sind, wodurch die Notwendigkeit typischer invasiver Elektroden, die Neuronen stimulieren, entfällt und eine unerwünschte Stimulation der Muskelzellen durch Elektrodenvermieden wird 23. Dieses System verwendet optogenetische Motoneuronen, um Kontraktionen in nicht-optogenetischen Skelettmuskelzellen zu stimulieren. Durch die Kombination von Videoerfassung und kontrollierter Blaulichtbeleuchtung können die gemeinsam kultivierten Gewebe gleichzeitig stimuliert und für die NMJ-Funktion aufgezeichnet werden.
MG wird durch Autoantikörper verursacht, die auf nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChR) abzielen, was zu einer verminderten NMJ-Funktion und Muskelschwäche führt24. Es wird auf der Grundlage der vorgestellten Symptome, der Elektrodiagnose und des Nachweises von Autoantikörpern durch serologische Bluttests diagnostiziert. Es wurden jedoch nicht alle an MG beteiligten Autoantikörper identifiziert, und bei einigen seronegativen Patienten wird MG diagnostiziert, aber ohne anerkannte Antikörper25,26. Unser System ermöglicht eine wiederholte funktionelle Beurteilung des NMJ vor und nach der Zugabe von Serum von MG-Patienten und liefert unschätzbare Einblicke in die funktionellen und biochemischen Veränderungen, die durch die MG-Antikörper verursachtwerden 18. Unser Protokoll veranschaulicht, wie 3D-In-vitro-Modelle von funktionellem menschlichem NMJ erstellt werden können, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Wir demonstrieren die Vielseitigkeit des Systems in zwei Plattformen, einem mikrofluidischen Gerät und einer größeren Open-Well-Bioreaktorplattform.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses System ist ein entwickeltes 3D-Modell für menschliches Gewebe, das Optogenetik und Videoverarbeitung kombiniert, um eine automatisierte und unvoreingenommene Bewertung der NMJ-Funktion zu ermöglichen. Mit einem standardisierten Protokoll haben wir die Fähigkeit nachgewiesen, Veränderungen der NMJ-Funktion während der physiologischen Entwicklung zu messen und die schädlichen Auswirkungen von Pathologien wie Neurotoxinexposition und Myasthenia gravis Patientenseren zu charakterisieren.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Finanzierung durch das NIH [Fördernummern EB025765 und EB027062], das DOD [Vergabenummer W81XWH-18-1-0095] und die UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Wir danken dem Stammzellkern der Columbia University für seine Hilfe und Anleitung bei der Zellumprogrammierung.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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