הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי
Summary
אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.
Abstract
מחלות נוירומוסקולריות רבות, כגון myasthenia gravis (MG), קשורות לתפקוד לקוי של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ), שקשה לאפיין אותו במודלים של בעלי חיים בשל הבדלים פיזיולוגיים בין בעלי חיים לבני אדם. הנדסת רקמות מציעה הזדמנויות לספק מודלים במבחנה של NMJs אנושיים פונקציונליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. על-ידי שילוב חלבונים אופטוגנטיים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יצרנו נוירונים שיכולים להיות מגורה עם אורכי גל ספציפיים של אור. אם ה- NMJ בריא ומתפקד, אות נוירוכימי מהמוטונורון גורם להתכווצות שרירים. באמצעות שילוב של אופטוגנטיקה ומיקרו-פבריקציה עם הנדסת רקמות, הקמנו מתודולוגיה בלתי משוחדת ואוטומטית לאפיון תפקודי NMJ באמצעות ניתוח וידאו. פותח פרוטוקול סטנדרטי להיווצרות NMJ, גירוי אופטי עם הקלטת וידאו סימולטנית, וניתוח וידאו של התכווצות רקמות. גירוי של מוטונים אופטוגנטיים על ידי אור כדי לגרום להתכווצויות שרירי השלד משחזר את הפיזיולוגיה האנושית של NMJ ומאפשר מדידות תפקודיות חוזרות ונשנות של NMJ לאורך זמן ובתגובה לקלטים שונים. אנו מדגימים את יכולתה של פלטפורמה זו להראות שיפורים תפקודיים בקישוריות הנוירומוסקולרית לאורך זמן ולאפיין את ההשפעות המזיקות של נוגדני MG או טטוקסינים עצביים בחולים על תפקוד NMJ.
Introduction
הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא הסינפסה הכימית בין מוטונרונים (MNs) לתאי שריר השלד (SkM) המאפשרת התכווצות שרירים. רעלנים, כגון נוירוטוקסין α-בונגארוטוקסין (BTX), או מחלות נוירומוסקולריות (NMD) כמו מיאסתניה גרביס (MG) יכולים להוביל לניוון של NMJ ולהפחתה בשליטה בשרירים1. מודלים של רקמות אנושיות מהונדסות ביולוגית משחזרים טוב יותר את המנגנונים התפקודיים והפיזיולוגיים של NMJs אנושיים ומציעים פוטנציאל תרגומי גדול יותר מאשר מודלים של בעלי חיים.
בעוד שמודלים של בעלי חיים קידמו את ההבנה של היווצרות ותפקוד ה- NMJ, ישנם הבדלים משמעותיים בין סינפסות של בני אדם ובעלי חיים המגבילים את תרגום התוצאות לבני אדם והופכים את אפיון in vivo של NMJ למאתגר 2,3,4. מחקרים הראו הבדלים פיזיולוגיים מובהקים בין NMJs של עכברים לבני אדם. לעכברים יש NMJs גדולים יותר וצפיפות אזורים פעילים קטנה יותר בהשוואה ל-NMJs4 אנושיים. בנוסף, מחקרים תרופתיים שנערכו במודלים של בעלי חיים לא תמיד משקפים את ההשפעות שנמצאו בניסויים קליניים בבני אדם. מודלים מהונדסים של רקמות אנושיות מספקים את ההזדמנות לחקור את ההתפתחות הבריאה של NMJ ואת הפתולוגיה של מחלות נוירומוסקולריות ולאפשר הקרנות תרופות. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם (hiPSCs)5 יכולים להתמיין למגוון סוגי תאים, כולל תאי שריר השלד 6,7 ומוטונורונים 8,9. hiPSCs יכולים להיווצר בקלות מתאי המטופל, מה שמאפשר מודלים טובים יותר של מחלות10 ובדיקת תרופות11,12 באמצעות מודלים של רקמות ספציפיות לחולה.
תרבויות חד-שכבתיות דו-ממדיות (2D) של SkMs ו-MNs חסרות את המורפולוגיה, הפנוטיפ, הארגון וההתנהגות התפקודית של NMJs פיזיולוגיים. NMJs נוצרים באופן אקראי בתרבית דו-ממדית, מה שמעכב את הבידוד של יחידות מוטוריות לניתוח, מגביל מדידות תפקודיות מדויקות ומונע את השימוש בהן לניסויים חוזרים ושיטתיים13 . מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמות NMJs מתגברים על רבות מהמגבלות הללו, ומשחזרים את המאפיינים המורפולוגיים והתפקודיים של NMJs פיזיולוגיים 7,14,15,16,17. באמצעות מודל זה, שני סוגי הרקמות מפותחים בנפרד ולאחר מכן משולבים על ידי הכוונת הצמיחה האקסונלית, מה שמאפשר לפתח NMJs מאורגנים יותר בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות.
המחקר הקודם שלנו הראה כי שילוב של אופטוגנטיקה עם הנדסת רקמות יכול לאפשר גירוי לא פולשני מדויק והערכה של תפקוד NMJ18,19. באמצעות הנדסה גנטית, חלבונים רגישים לאור יכולים להיות משולבים בגנום של hiPSCs. שילוב channelrhodopsin-2 (ChR2), תעלת יונים הנפתחת בתגובה לאור כחול, לתוך הממברנה של תאים נרגשים כגון נוירונים מאפשרת שליטה מרחבית-טמפורלית ללא מגע על הפעלת התא 20,21,22. hiPSCs הנושאים ChR2 ניתנים להבחנה למוטונורונים אופטוגנטיים הרגישים לאור כחול, ובכך מבטלים את הצורך באלקטרודות פולשניות טיפוסיות הממריצות נוירונים ונמנעים מגירוי לא רצוי של תאי השריר על ידי אלקטרודות23. מערכת זו משתמשת במוטונורונים אופטוגנטיים כדי לעורר התכווצויות בתאי שרירי שלד שאינם אופטוגנטיים. שילוב של רכישת וידאו ותאורת אור כחול מבוקרת מאפשר לעורר ולהקליט בו-זמנית את הרקמות שעברו תרבית משותפת לתפקוד NMJ.
MG נגרמת על ידי נוגדנים עצמיים המכוונים נגד קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChR), מה שמביא לירידה בתפקוד NMJ ולחולשת שרירים24. הוא מאובחן על סמך הסימפטומים המוצגים, אלקטרודיאגנוזה וזיהוי נוגדנים עצמיים באמצעות בדיקות דם סרולוגיות. עם זאת, לא כל נוגדנים עצמיים המעורבים ב- MG זוהו, וחלק מהחולים הסרונגטיביים מאובחנים עם MG אך ללא נוגדנים מוכרים 25,26. המערכת שלנו מאפשרת הערכה תפקודית חוזרת ונשנית של ה- NMJ לפני ואחרי הוספת הסרום ממטופלי MG, ומספקת תובנה שלא תסולא בפז לגבי השינויים התפקודיים והביוכימיים הנגרמים על ידי נוגדני MG18. הפרוטוקול שלנו ממחיש כיצד לייצר מודלים תלת-ממדיים במבחנה של NMJ אנושי תפקודי שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן ולחקור פתולוגיות של NMJ ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. אנו מדגימים את הרבגוניות של המערכת בשתי פלטפורמות, התקן מיקרופלואידי ופלטפורמת ביו-ריאקטורים גדולה יותר עם באר פתוחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת זו היא מודל רקמות אנושיות תלת-ממדי מהונדס המשלב אופטוגנטיקה ועיבוד וידאו כדי לאפשר הערכה אוטומטית ובלתי משוחדת של תפקוד NMJ. באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, הדגמנו את היכולת למדוד שינויים בתפקוד NMJ במהלך ההתפתחות הפיזיולוגית ולאפיין את ההשפעות המזיקות של פתולוגיות כגון חשיפה לנוירוטוקסי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על תמיכת המימון על ידי ה- NIH [מספרי המענק EB025765 ו- EB027062], DOD [מספר הפרס W81XWH-18-18-1-0095], והחדשנות בבריאות של UCSF באמצעות הנדסה (מלגת HIVE). אנו מודים תודה לליבת תאי הגזע של אוניברסיטת קולומביה על עזרתם והדרכתם בתכנות מחדש של תאים.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
