Summary

Ingeniería y caracterización de un modelo optogenético de la unión neuromuscular humana

Published: April 14, 2022
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Summary

Describimos un sistema de imágenes reproducible, automatizado e imparcial para caracterizar la función de la unión neuromuscular utilizando tejido muscular esquelético diseñado por humanos y motoneuronas optogenéticas. Este sistema permite la cuantificación funcional de la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y detecta la disminución de la función neuromuscular causada por las neurotoxinas y la miastenia gravis en el suero del paciente.

Abstract

Muchas enfermedades neuromusculares, como la miastenia gravis (MG), están asociadas con la disfunción de la unión neuromuscular (NMJ), que es difícil de caracterizar en modelos animales debido a las diferencias fisiológicas entre animales y humanos. La ingeniería de tejidos ofrece oportunidades para proporcionar modelos in vitro de NMJ humanos funcionales que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Al incorporar proteínas optogenéticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSC), generamos neuronas que pueden ser estimuladas con longitudes de onda específicas de luz. Si el NMJ es saludable y funcional, una señal neuroquímica de la motoneurona resulta en la contracción muscular. A través de la integración de la optogenética y la microfabricación con la ingeniería de tejidos, establecimos una metodología imparcial y automatizada para caracterizar la función NMJ utilizando el análisis de video. Se desarrolló un protocolo estandarizado para la formación de NMJ, la estimulación óptica con grabación de video simultánea y el análisis de video de la contractilidad del tejido. La estimulación de motoneuronas optogenéticas por la luz para inducir contracciones del músculo esquelético recapitula la fisiología humana de NMJ y permite mediciones funcionales repetidas de NMJ a lo largo del tiempo y en respuesta a diversas entradas. Demostramos la capacidad de esta plataforma para mostrar mejoras funcionales en la conectividad neuromuscular a lo largo del tiempo y caracterizar los efectos dañinos de los anticuerpos MG o neurotoxinas del paciente en la función NMJ.

Introduction

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis química entre las motoneuronas (MN) y las células del músculo esquelético (SkM) que permite la contracción muscular. Las toxinas, como la neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), o las enfermedades neuromusculares (NMD) como la miastenia gravis (MG) pueden conducir a la degeneración de la NMJ y reducciones en el control muscular1. Los modelos de tejidos humanos de bioingeniería recapitulan mejor los mecanismos funcionales y fisiológicos de los NMJ humanos y ofrecen un mayor potencial de traducción que los modelos animales.

Si bien los modelos animales han avanzado en la comprensión de la formación y función del NMJ, existen diferencias significativas entre las sinapsis humanas y animales que limitan la traducción de los resultados a los humanos y hacen que la caracterización in vivo del NMJ sea un desafío 2,3,4. Los estudios han demostrado diferencias fisiológicas distintas entre los NMJ de ratón y humanos. Los ratones tienen NMJ más grandes y densidades de zona activa más pequeñas en comparación con los NMJ humanos4. Además, los estudios de medicamentos realizados en modelos animales no siempre reflejan los efectos encontrados en los ensayos clínicos en humanos. Los modelos de tejido humano diseñados brindan la oportunidad de estudiar el desarrollo saludable de la NMJ y la patología de las enfermedades neuromusculares y permiten la detección de drogas. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs)5 se pueden diferenciar en una variedad de tipos de células, incluidas las células del músculo esquelético 6,7 y las motoneuronas 8,9. Las hiPSC se pueden generar fácilmente a partir de células de pacientes, lo que permite un mejor modelado de la enfermedad10 y la detección de fármacos11,12 a través de modelos de tejido específicos del paciente.

Los cocultivos monocapa bidimensionales (2D) de SkMs y MNs carecen de la morfología, fenotipo, organización y comportamiento funcional de los NMJ fisiológicos. Los NMJ se forman aleatoriamente en cultivo 2D, lo que inhibe el aislamiento de unidades motoras para su análisis, limita las mediciones funcionales precisas e impide su uso para experimentos repetidos y sistemáticos13 . Los modelos tisulares tridimensionales (3D) de NMJ superan muchas de estas limitaciones, recapitulando las características morfológicas y funcionales de los NMJ fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, los dos tipos de tejido se desarrollan por separado y luego se integran dirigiendo el crecimiento axonal, lo que permite que se desarrollen NMJ más organizados en comparación con los sistemas de cultivo 2D.

Nuestro estudio anterior demostró que la combinación de optogenética con ingeniería de tejidos puede permitir una estimulación no invasiva precisa y una evaluación de la función NMJ18,19. A través de la ingeniería genética, las proteínas sensibles a la luz se pueden integrar en el genoma de las hiPSC. La integración de la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal iónico que se abre en respuesta a la luz azul, en la membrana de células excitables como las neuronas permite el control espaciotemporal sin contacto sobre la activación celular 20,21,22. Las hiPSC que transportan ChR2 se pueden diferenciar en motoneuronas optogenéticas sensibles a la luz azul, eliminando la necesidad de electrodos invasivos típicos que estimulan las neuronas y evitando la estimulación no deseada de las células musculares por electrodos23. Este sistema utiliza motoneuronas optogenéticas para estimular las contracciones en las células del músculo esquelético no optogenético. La combinación de la adquisición de video y la iluminación controlada de luz azul permite que los tejidos cocultivados se estimulen y graben simultáneamente para la función NMJ.

La MG es causada por autoanticuerpos dirigidos a los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR), lo que resulta en una disminución de la función NMJ y debilidad muscular24. Se diagnostica en función de los síntomas presentados, el electrodiagnóstico y la detección de autoanticuerpos a través de análisis de sangre serológicos. Sin embargo, no se han identificado todos los autoanticuerpos implicados en la MG, y algunos pacientes seronegativos son diagnosticados con MG pero sin anticuerpos reconocidos25,26. Nuestro sistema permite la evaluación funcional repetida de la NMJ antes y después de la adición de suero de pacientes con MG, proporcionando información invaluable sobre los cambios funcionales y bioquímicos causados por los anticuerpos MG18. Nuestro protocolo ilustra cómo producir modelos 3D in vitro de NMJ humana funcional que se pueden utilizar para diagnosticar e investigar patologías de NMJ y probar posibles terapias. Demostramos la versatilidad del sistema en dos plataformas, un dispositivo microfluídico y una plataforma de biorreactor de pozo abierto más grande.

Protocol

Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE. UU. 1. Preparación del biorreactor Hacer moldes de biorreactores Descargue un archivo CAD de biorreactor desde el archivo CAD complementario o cree un diseño propio personalizado. Genere una trayectoria de herramienta CNC a partir del modelo 3D utilizando el software CAM.<…

Representative Results

Las uniones neuromusculares se generaron mediante el co-cultivo de motoneuronas derivadas de hiPSC optogenéticas con tejido muscular esquelético no optogenético. Los mioblastos esqueléticos primarios humanos (SkM) se sembraron en las plataformas y se diferenciaron en miotubos multinucleados utilizando el protocolo de 2 semanas. Las motoneuronas optogenéticas se diferenciaron por separado, pero en paralelo con la diferenciación de miotubos, y luego se sembraron en la plataforma (Figura 1</strong…

Discussion

Este sistema es un modelo de tejido humano 3D diseñado que combina optogenética y procesamiento de video para permitir una evaluación automatizada e imparcial de la función NMJ. Utilizando un protocolo estandarizado, hemos demostrado la capacidad de medir los cambios en la función de NMJ durante el desarrollo fisiológico y caracterizar los efectos dañinos de patologías como la exposición a neurotoxinas y los sueros de pacientes con miastenia gravis.

Estudios previos han reportado la c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos el apoyo financiero de los NIH [números de subvención EB025765 y EB027062], el DOD [número de premio W81XWH-18-1-0095] y la UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos al Núcleo de Células Madre de la Universidad de Columbia por su ayuda y orientación con la reprogramación celular.

Materials

Cells
SkMDC Cook Myosite P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634-020
Bovine Serum Albumin solution Millipore Sigma A9576-50ML
G-5 Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 10131-035
Insulin, Recombinant Human Millipore Sigma 91077C-100MG
Matrigel Corning 354277
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 100-0276
MyoTonic Growth Media Kit Cook Myosite MK-4444
N-2 Supplement ThermoFisher Scientific 17502-048
NBactiv4 500 mL BrainBits LLC Nb4-500
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103-049
Neurobasal-A Medium ThermoFisher Scientific A13710-01
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P2443
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872
Plasticware
30 mm cage cube system ThorLabs CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large Stem Cell Technologies 27250
546 nm short-pass excitation filter Semrock FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror Semrock FF573-Di01–25×36
594 nm long- pass emission filter Semrock BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter Semrock BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs LuxeonStarLEDs 10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish Corning 3261
Heat sink LuxeonStarLEDs LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile PluriSelect 43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA LuxeonStarLEDs SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm ThorLabs SM1D12D
T-Cube LED drivers ThorLabs LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" McMaster 91920A046
Low-Profile C-Clamp McMaster 1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate Millipore Sigma A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg Tocris 4423/10
DAPT 10 mg R&D Systems 2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg Miltenyl Biotec 130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF R&D Systems 2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein ThermoFisher Scientific PHG0078
Laminin mouse protein, natural ThermoFisher Scientific 23017015
Recombinant Human Agrin Protein R&D Systems 6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug R&D Systems 212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug Cell Sciences CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4 Cell Sciences CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus R&D Systems 1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug Peprotech 450-02
Retinoic Acid, 50 mg Millipore Sigma R2625-50
SAG Smoothened Agonist Millipore Sigma 566660
SB431542 10 mg Stem Cell Technologies 72234
StemMACS LDN-193189 Miltenyl Biotec 130-103-925
Vitronectin from human plasma Millipore Sigma V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1) Abcam ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) Millipore AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1) Dako M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) DSHB MF20
Equipment
Arduino Uno R3 Arduino A000066
Automated stage Applied scientific instrumentation MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Marshal Scientific I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope Olympus IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System Tokai Hit STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera Andor Technology ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE) Arduino IDE 1.8.19
Mastercam Mastercam Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab R2021b
NIS elements Nikon Basic Research
Solidworks 3D CAD Solidworks Solidworks Standard

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Liberman, M., Chavez, M., Nash, T. R., Vila, O. F., Vunjak-Novakovic, G. Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (182), e63759, doi:10.3791/63759 (2022).

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