Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana
Summary
Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.
Abstract
Molte malattie neuromuscolari, come la miastenia grave (MG), sono associate a disfunzione della giunzione neuromuscolare (NMJ), che è difficile da caratterizzare nei modelli animali a causa delle differenze fisiologiche tra animali e umani. L’ingegneria tissutale offre l’opportunità di fornire modelli in vitro di NMJ umani funzionali che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Incorporando proteine optogenetiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), abbiamo generato neuroni che possono essere stimolati con specifiche lunghezze d’onda della luce. Se l’NMJ è sano e funzionale, un segnale neurochimico dal motoneurone provoca la contrazione muscolare. Attraverso l’integrazione dell’optogenetica e della microfabbricazione con l’ingegneria tissutale, abbiamo stabilito una metodologia imparziale e automatizzata per caratterizzare la funzione NMJ utilizzando l’analisi video. È stato sviluppato un protocollo standardizzato per la formazione di NMJ, la stimolazione ottica con registrazione video simultanea e l’analisi video della contrattilità tissutale. La stimolazione dei motoneuroni optogenetici da parte della luce per indurre contrazioni muscolari scheletriche ricapitola la fisiologia NMJ umana e consente ripetute misurazioni funzionali di NMJ nel tempo e in risposta a vari input. Dimostriamo la capacità di questa piattaforma di mostrare miglioramenti funzionali nella connettività neuromuscolare nel tempo e caratterizzare gli effetti dannosi degli anticorpi MG del paziente o delle neurotossine sulla funzione NMJ.
Introduction
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi chimica tra motoneuroni (MN) e cellule muscolari scheletriche (SkM) che consente la contrazione muscolare. Le tossine, come la neurotossina α-bungarotossina (BTX), o le malattie neuromuscolari (NMD) come la miastenia grave (MG) possono portare alla degenerazione del NMJ e alla riduzione del controllo muscolare1. I modelli di tessuto umano bioingegnerizzati ricapitolano meglio i meccanismi funzionali e fisiologici degli NMJ umani e offrono un maggiore potenziale traslazionale rispetto ai modelli animali.
Mentre i modelli animali hanno avanzato la comprensione della formazione e della funzione del NMJ, ci sono differenze significative tra sinapsi umane e animali che limitano la traduzione dei risultati all’uomo e rendono la caratterizzazione in vivo del NMJ impegnativo 2,3,4. Gli studi hanno mostrato differenze fisiologiche distinte tra NMJ di topo e umani. I topi hanno NMJ più grandi e densità di zone attive più piccole rispetto agli NMJ umani4. Inoltre, gli studi farmacologici condotti su modelli animali non sempre riflettono gli effetti riscontrati negli studi clinici sull’uomo. I modelli di tessuto umano ingegnerizzati offrono l’opportunità di studiare lo sviluppo sano del NMJ e la patologia delle malattie neuromuscolari e consentono screening farmacologici. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSCs)5 possono essere differenziate in una varietà di tipi di cellule, comprese le cellule muscolari scheletriche 6,7 e i motoneuroni 8,9. Le hiPSC possono essere generate facilmente dalle cellule del paziente, consentendo una migliore modellazione della malattia10 e lo screening farmacologico 11,12 attraverso modelli tissutali specifici per il paziente.
Le co-colture monostrato bidimensionali (2D) di SkM e MN mancano della morfologia, del fenotipo, dell’organizzazione e del comportamento funzionale degli NMJ fisiologici. Gli NMJ si formano casualmente in coltura 2D, il che inibisce l’isolamento delle unità motorie per l’analisi, limita le misurazioni funzionali accurate e ne impedisce l’uso per esperimenti ripetuti e sistematici13 . I modelli tissutali tridimensionali (3D) di NMJ superano molte di queste limitazioni, ricapitolando le caratteristiche morfologiche e funzionali delle NMJ fisiologiche 7,14,15,16,17. Utilizzando questo modello, i due tipi di tessuto vengono sviluppati separatamente e quindi integrati dirigendo la crescita assonale, consentendo lo sviluppo di NMJ più organizzati rispetto ai sistemi di coltura 2D.
Il nostro studio precedente ha dimostrato che la combinazione di optogenetica con l’ingegneria tissutale può consentire un’accurata stimolazione non invasiva e la valutazione della funzione NMJ18,19. Attraverso l’ingegneria genetica, le proteine sensibili alla luce possono essere integrate nel genoma delle hiPSC. L’integrazione di channelrhodopsin-2 (ChR2), un canale ionico che si apre in risposta alla luce blu, nella membrana di cellule eccitabili come i neuroni consente il controllo spaziotemporale senza contatto sull’attivazione cellulare 20,21,22. Le hiPSC che trasportano ChR2 possono essere differenziate in motoneuroni optogenetici sensibili alla luce blu, eliminando la necessità di elettrodi invasivi tipici che stimolano i neuroni ed evitando la stimolazione indesiderata delle cellule muscolari da parte degli elettrodi23. Questo sistema utilizza motoneuroni optogenetici per stimolare le contrazioni nelle cellule muscolari scheletriche non optogenetiche. La combinazione di acquisizione video e illuminazione controllata della luce blu consente di stimolare e registrare simultaneamente i tessuti co-coltivati per la funzione NMJ.
MG è causato da autoanticorpi che prendono di mira i recettori nicotinici dell’acetilcolina (AChR), che si traduce in diminuzione della funzione NMJ e debolezza muscolare24. Viene diagnosticata in base ai sintomi presentati, all’elettrodiagnosi e al rilevamento di autoanticorpi tramite esami del sangue sierologici. Tuttavia, non tutti gli autoanticorpi coinvolti nella MG sono stati identificati e ad alcuni pazienti sieronegativi viene diagnosticata la MG ma senza anticorpi riconosciuti25,26. Il nostro sistema consente una valutazione funzionale ripetuta dell’NMJ prima e dopo l’aggiunta di siero da pazienti con MG, fornendo preziose informazioni sui cambiamenti funzionali e biochimici causati dagli anticorpi MG18. Il nostro protocollo illustra come produrre modelli 3D in vitro di NMJ umano funzionale che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Dimostriamo la versatilità del sistema in due piattaforme, un dispositivo microfluidico e una più grande piattaforma di bioreattore a pozzo aperto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo sistema è un modello di tessuto umano 3D ingegnerizzato che combina optogenetica ed elaborazione video per consentire una valutazione automatizzata e imparziale della funzione NMJ. Utilizzando un protocollo standardizzato, abbiamo dimostrato la capacità di misurare i cambiamenti nella funzione NMJ durante lo sviluppo fisiologico e caratterizzare gli effetti dannosi di patologie come l’esposizione alle neurotossine e la miastenia gravis dei sieri dei pazienti.
Studi precedenti hanno ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte del NIH [numeri di sovvenzione EB025765 e EB027062], DOD [numero di premio W81XWH-18-1-0095] e UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Riconosciamo con gratitudine il nucleo di cellule staminali della Columbia University per il loro aiuto e guida con la riprogrammazione cellulare.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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