ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け
Summary
我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。
Abstract
重症筋無力症(MG)などの多くの神経筋疾患は、神経筋接合部(NMJ)の機能不全と関連しており、動物とヒトの生理学的差異のために動物モデルで特徴付けることは困難である。組織工学は、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの in vitro モデルを提供する機会を提供します。誘導多能性幹細胞(iPSC)に光遺伝学的タンパク質を組み込むことで、特定の波長の光で刺激できるニューロンを作製しました。NMJが健康で機能的である場合、運動ニューロンからの神経化学的シグナルは筋肉収縮をもたらす。光遺伝学と微細加工を組織工学と統合することにより、ビデオ解析を使用してNMJ機能を特徴付けるための偏りのない自動化された方法論を確立しました。NMJ形成、同時ビデオ録画による光刺激、および組織収縮性のビデオ分析のために標準化されたプロトコルが開発された。骨格筋収縮を誘導するための光による光遺伝学的運動ニューロンの刺激は、ヒトNMJ生理学を反復し、時間の経過とともに様々な入力に応答してNMJの反復機能測定を可能にする。我々は、このプラットフォームの能力が時間の経過とともに神経筋接続性の機能的改善を示し、NMJ機能に対する患者のMG抗体または神経毒の有害な影響を特徴付ける能力を実証します。
Introduction
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロン(MN)と骨格筋細胞(SkM)との間の化学シナプスであり、筋肉の収縮を可能にする。神経毒α – バンガロトキシン(BTX)などの毒素、または重症筋無力症(MG)のような神経筋疾患(NMD)は、NMJの変性および筋肉制御の低下をもたらし得る1。バイオエンジニアリングされたヒト組織モデルは、ヒトNMJの機能的および生理学的メカニズムをよりよく再現し、動物モデルよりも大きな翻訳可能性を提供する。
動物モデルはNMJの形成と機能の理解を進めてきたが、ヒトと動物のシナプスの間には、ヒトへの結果の翻訳を制限し、NMJのインビボ特性評価を困難にする有意な違いがある2,3,4。研究では、マウスとヒトのNMJの間に明確な生理学的違いが示されています。マウスは、ヒトNMJと比較してNMJが大きく、活性ゾーン密度が小さくなっています4。さらに、動物モデルで実施された薬物研究は、ヒト臨床試験で見出された効果を必ずしも反映しているとは限らない。操作されたヒト組織モデルは、NMJの健全な発達および神経筋疾患の病理を研究する機会を提供し、薬物スクリーニングを可能にする。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)5は、骨格筋細胞6,7および運動ニューロン8,9を含む様々な細胞型に分化させることができる。hiPSCは患者細胞から容易に生成することができ、患者固有の組織モデルを通じて、より良い疾患モデリング10および薬物スクリーニング11,12を可能にする。
SkMsとMNの2次元(2D)単層共培養は、生理学的NMJの形態、表現型、組織、および機能的挙動を欠いている。 NMJは2D培養においてランダムに形成され、分析のための運動ユニットの単離を阻害し、正確な機能測定を制限し、反復的で体系的な実験のためのそれらの使用を妨げる13.NMJの3次元(3D)組織モデルは、これらの制限の多くを克服し、生理学的NMJの形態学的および機能的特徴を反復する7、14、15、16、17。このモデルを使用して、2つの組織タイプを別々に開発し、軸索成長を導くことによって統合し、2D培養システムと比較してより組織化されたNMJを発達させることを可能にする。
我々の以前の研究は、光遺伝学と組織工学を組み合わせることで、NMJ機能の正確な非侵襲的刺激および評価を可能にすることを実証した18,19。遺伝子工学を通じて、光感受性タンパク質をhiPSCのゲノムに組み込むことができます。青色光に応答して開くイオンチャネルであるチャネルロドプシン-2(ChR2)をニューロンなどの興奮性細胞の膜に統合することで、細胞活性化に対する非接触時空間制御が可能になる20、21、22。ChR2を担持するhiPSCは、青色光に敏感な光遺伝学的運動ニューロンに分化することができ、ニューロンを刺激する典型的な侵襲的電極の必要性を排除し、電極23による筋細胞の望ましくない刺激を回避する。このシステムは、光遺伝学的運動ニューロンを使用して、非光遺伝学的骨格筋細胞の収縮を刺激する。ビデオ取得と制御された青色光照明を組み合わせることで、共培養組織を同時に刺激し、NMJ機能のために記録することができます。
MGは、ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)を標的とする自己抗体によって引き起こされ、NMJ機能の低下および筋力低下をもたらす24。これは、提示された症状、電気診断、および血清学的血液検査による自己抗体の検出に基づいて診断される。しかし、MGに関与するすべての自己抗体が同定されているわけではなく、一部の血清陰性患者はMGと診断されているが、認識された抗体はない25,26。我々のシステムは、MG患者からの血清の添加前後のNMJの繰り返しの機能評価を可能にし、MG抗体によって引き起こされる機能的および生化学的変化に関する非常に貴重な洞察を提供する18。当社のプロトコルは、NMJ病理の診断と調査、および潜在的な治療法の試験に使用できる機能的ヒトNMJの3Dインビトロモデルを作成する方法を示しています。我々は、マイクロ流体デバイスとより大きなオープンウェルバイオリアクタープラットフォームの2つのプラットフォームでシステムの汎用性を実証しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このシステムは、光遺伝学とビデオ処理を組み合わせて、NMJ機能の自動的かつ偏りのない評価を可能にする、設計された3Dヒト組織モデルです。標準化されたプロトコールを用いて、生理学的発達中のNMJ機能の変化を測定し、神経毒曝露および重症筋無力症患者血清などの病状の有害な影響を特徴付ける能力を実証した。
以前の研究は、MG患者血清を用いた骨格筋管との?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、NIH[助成金番号EB025765及びEB027062]、国防総省[受賞番号W81XWH-18-1-0095]及びUCSFヘルス・イノベーション・バイ・エンジニアリング(HIVEフェローシップ)による資金支援に感謝する。コロンビア大学幹細胞コアの細胞リプログラミングに関する支援と指導に感謝します。
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
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