Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana

Summary

Descrevemos um sistema de imagem reprodutível, automatizado e imparcial para caracterizar a função de junção neuromuscular usando tecido muscular esquelético projetado por humanos e motoneurons optogenéticos. Este sistema permite a quantificação funcional da conectividade neuromuscular ao longo do tempo e detecta a função neuromuscular diminuída causada por neurotoxinas e soro do paciente myasthenia gravis.

Abstract

Muitas doenças neuromusculares, como a miasthenia gravis (MG), estão associadas à disfunção da junção neuromuscular (NMJ), difícil de caracterizar em modelos animais devido a diferenças fisiológicas entre animais e humanos. A engenharia de tecidos oferece oportunidades para fornecer modelos in vitro de NMJs humanos funcionais que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Ao incorporar proteínas optogenéticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), geramos neurônios que podem ser estimulados com comprimentos de onda específicos de luz. Se o NMJ estiver saudável e funcional, um sinal neuroquímico do motoneuron resulta em contração muscular. Através da integração da optogenética e microfabagem com a engenharia de tecidos, estabelecemos uma metodologia imparcial e automatizada para caracterização da função NMJ utilizando análise de vídeo. Foi desenvolvido um protocolo padronizado para formação de NMJ, estimulação óptica com gravação simultânea de vídeo e análise de vídeo da contratude tecidual. A estimulação de motoneurons optogenéticos pela luz para induzir contrações musculares esqueléticas recapitula a fisiologia do NMJ humano e permite medições funcionais repetidas de NMJ ao longo do tempo e em resposta a várias entradas. Demonstramos a capacidade desta plataforma de mostrar melhorias funcionais na conectividade neuromuscular ao longo do tempo e caracterizar os efeitos nocivos dos anticorpos do paciente MG ou neurotoxinas na função NMJ.

Introduction

A junção neuromuscular (NMJ) é a sinapse química entre motoneurons (MNs) e células musculares esqueléticas (TLM) que permite contração muscular. Toxinas, como neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), ou doenças neuromusculares (DNM) como a miasthenia gravis (MG) podem levar à degeneração do NMJ e reduções no controle muscular¹. Modelos de tecido humano bioengenharia melhor recapituam melhor os mecanismos funcionais e fisiológicos dos NMJs humanos e oferecem maior potencial translacional do que os modelos animais.

Embora os modelos animais tenham avançado o entendimento da formação e função do NMJ, há diferenças significativas entre sinapses humanas e animais que limitam a tradução dos resultados para humanos e fazem com que a caracterização in vivo do NMJ desafie ^2,3,4. Estudos têm mostrado diferenças fisiológicas distintas entre NMJs de camundongos e humanos. Os ratos têm NMJs maiores e densidades de zonas ativas menores quando comparados aos NMJs^{humanos 4}. Além disso, estudos medicamentosos realizados em modelos animais nem sempre refletem os efeitos encontrados em ensaios clínicos em humanos. Modelos de tecido humano projetados proporcionam a oportunidade de estudar o desenvolvimento saudável do NMJ e a patologia das doenças neuromusculares e permitir a triagem de medicamentos. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs)⁵ podem ser diferenciadas em uma variedade de tipos de células, incluindo células musculares esqueléticas ^6,7 e motoneurons ^8,9. hiPSCs podem ser gerados facilmente a partir de células do paciente, permitindo uma melhor modelagem da doença¹⁰ e triagem de medicamentos^11,12 através de modelos de tecido específicos do paciente.

As co-culturas monocamadas bidimensionais (2D) de SkMs e MNs carecem da morfologia, fenótipo, organização e comportamento funcional de NMJs fisiológicos. Os NMJs formam aleatoriamente na cultura 2D, o que inibe o isolamento de unidades motoras para análise, limita medições funcionais precisas e impede seu uso para experimentos repetidos e sistemáticos¹³ . Modelos tridimensionais (3D) de tecidos de NMJs superam muitas dessas limitações, recapitulando as características morfológicas e funcionais dos NMJs fisiológicos 7,14,15,16,17. Usando este modelo, os dois tipos de tecidos são desenvolvidos separadamente e depois integrados direcionando o crescimento axonal, permitindo que NMJs mais organizados se desenvolvam em comparação com sistemas de cultura 2D.

Nosso estudo anterior demonstrou que a combinação da optogenética com a engenharia de tecidos pode permitir uma estimulação e avaliação precisas não invasivas da função NMJ^18,19. Através da engenharia genética, proteínas sensíveis à luz podem ser integradas ao genoma dos hiPSCs. A integração do canalrhodopsin-2 (ChR2), um canal de íons que se abre em resposta à luz azul, na membrana de células excitáveis, como neurônios, permite o controle espostetemporal não-contato sobre a ativação^celular 20,21,22. hiPSCs portadores de ChR2 podem ser diferenciados em motoneurons optogenéticos sensíveis à luz azul, removendo a necessidade de eletrodos invasivos típicos que estimulam neurônios e evitando estimulação indesejada das células musculares por eletrodos²³. Este sistema usa motoneurons optogenéticos para estimular contrações em células musculares esqueléticas não optogenéticas. A combinação de aquisição de vídeo e iluminação de luz azul controlada permite que os tecidos co-cultivados sejam simultaneamente estimulados e gravados para a função NMJ.

MG é causada por autoanticorpos direcionados aos receptores de acetilcolina nicotínica (AChR), o que resulta na diminuição da função NMJ e fraqueza muscular²⁴. É diagnosticado com base em sintomas apresentados, eletrodiagnósmo e detecção de autoanticorpos através de exames de sangue sorológicos. No entanto, nem todos os autoanticorpos envolvidos em MG foram identificados, e alguns pacientes seronegativos são diagnosticados com MG, mas sem anticorpos reconhecidos^25,26. Nosso sistema permite uma avaliação funcional repetida do NMJ antes e depois da adição de soro de pacientes de MG, fornecendo uma visão inestimável das alterações funcionais e bioquímicas causadas pelos anticorpos^{MG 18}. Nosso protocolo ilustra como produzir modelos in vitro 3D de NMJ humano funcional que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Demonstramos a versatilidade do sistema em duas plataformas, um dispositivo microfluido e uma plataforma bioreatorial de poço aberto maior.

Protocol

Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA. 1. Preparação do bioreator Faça moldes bioreatores Baixe um arquivo CAD bioreator do Arquivo CAD Suplementar ou crie um design próprio personalizado. Gere um caminho de ferramentas CNC a partir do modelo 3D usando o software CAM. Moldes acetal da máquina usando um…

Representative Results

As junções neuromusculares foram geradas por motoneurons optogenéticos derivados do hiPSC com tecido muscular esquelético não optogenético. Myoblasts esqueléticos primários humanos (SkM) foram semeados nas plataformas e diferenciados em mosbos multinucleados usando o protocolo de 2 semanas. Os motoneurons optogenéticos foram diferenciados separadamente, mas em paralelo com a diferenciação do miotube, e depois semeados na plataforma (Figura 1). Os tecidos começaram a se contrair e…

Discussion

Este sistema é um modelo de tecido humano 3D projetado que combina optogenética e processamento de vídeo para permitir uma avaliação automatizada e imparcial da função NMJ. Utilizando um protocolo padronizado, demonstramos a capacidade de medir mudanças na função NMJ durante o desenvolvimento fisiológico e caracterizar os efeitos nocivos de patologias como exposição a neurotoxinas e myasthenia gravis paciente sera.

Estudos anteriores relataram a capacidade de modelar MG com motone…

Materials

Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NBactiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25×36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard