Summary
Denne artikel beskriver en teknik til hurtig human temporal knoglesektionering, der anvender en mikrosav med to diamantklinger til at generere tynde skiver til hurtig afkalkning og analyse af temporal knogleimmunosistokemi.
Abstract
Histopatologisk analyse af humane temporale knoglesektioner er en grundlæggende teknik til undersøgelse af indre og mellemørepatologi. Temporale knoglesektioner fremstilles ved postmortem temporal knoglehøst, fiksering, afkalkning, indlejring og farvning. På grund af tætheden af den tidlige knogle er afkalkning en tidskrævende og ressourceintensiv proces; komplet vævsforberedelse kan tage 9-10 måneder i gennemsnit. Dette bremser otopatologisk forskning og hindrer tidsfølsomme undersøgelser, såsom dem, der er relevante for COVID-19-pandemien. Dette papir beskriver en teknik til hurtig forberedelse og afkalkning af temporale knoglesektioner for at fremskynde vævsbehandling.
Temporale knogler blev høstet postmortem ved hjælp af standardteknikker og fastgjort i 10% formalin. En præcisionsmikrosav med to diamantklinger blev brugt til at skære hver sektion i tre tykke sektioner. Tykke temporale knoglesektioner blev derefter afkalket i afkalkningsopløsning i 7-10 dage, før de blev indlejret i paraffin, sektioneret i tynde (10 μm) sektioner ved hjælp af et kryotom og monteret på uladede dias. Vævsprøver blev derefter deparaffiniseret og rehydreret til antistoffarvning (ACE2, TMPRSS2, Furin) og afbildet. Denne teknik reducerede tiden fra høst til vævsanalyse fra 9-10 måneder til 10-14 dage. Højhastigheds temporal knoglesektionering kan øge hastigheden af otopatologisk forskning og reducere de ressourcer, der er nødvendige til vævsforberedelse, samtidig med at det letter tidsfølsomme undersøgelser som dem, der er relateret til COVID-19.
Introduction
Human temporal knogleforskning giver en uvurderlig ressource til at studere patologi og patofysiologi i det indre øre og mellemøret. Før det 19. århundrede var der lidt kendt om otologisk sygdom 1,2,3. For bedre at forstå otologisk sygdom og "redde lydkirurgi fra kvaksalverens hænder" udviklede Joseph Toynbee (1815-1866) metoder til at studere histologiske sektioner af den menneskelige temporale knogle3. Dette arbejde blev fremmet af Adam Politzer (1835-1920) i Wien og andre over hele Europa i resten af det 19. århundrede, der brugte tidsmæssige knoglesektioner til at beskrive histopatologien af mange almindelige tilstande, der påvirker øret 2,3,4.
Det første menneskelige temporale knoglelaboratorium i USA blev åbnet i 1927 på Johns Hopkins Hospital, hvor Stacy Guild (1890-1966) udviklede metoder til temporal knoglesektion 5,6. Metoderne udviklet af Guild bestod af en 9-10 måneders proces, der omfattede postmortem høst, fiksering, afkalkning i salpetersyre, dehydrering i ethanol, celloidinindlejring, sektionering, farvning og montering. Ændringer af denne teknik blev senere foretaget af Harold Schuknecht (1917-1996)7; de grundlæggende komponenter i denne proces forbliver dog stort set uændrede.
De betydelige ressourcer, der kræves for at opretholde et temporalt knoglelaboratorium, har udgjort en udfordring for temporal knogleforskning og sandsynligvis bidraget til dens faldende popularitet i løbet af de sidste 30 år 4,8. En betydelig del af temporale knoglelaboratorieressourcer skal afsættes til 9-10 måneders proces med temporal knogleforberedelse. Et af de mest tidskrævende trin i forberedelsen er afkalkningen af den tidlige knogle, som er den tætteste knogle i menneskekroppen. Afkalkning udføres typisk i salpetersyre eller ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og tager uger til måneder, mens det kræver hyppig skift af opløsninger 7,9. Desuden kan tidsfølsomme undersøgelser af det menneskelige øre, såsom dem, der er relateret til COVID-19-pandemien, hindres af denne langsomme forberedelsesproces. Dette papir beskriver en teknik til højhastigheds temporal knoglesektion, der bruger en diamantmikrosav til at generere tykke sektioner, der muliggør hurtig afkalkning og vævsanalyse inden for 10-14 dage efter temporal knoglehøst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev udviklet med IRB (IRB00250002) godkendelse og i overensstemmelse med institutionelle politikker for anvendelse af humant væv og infektiøst materiale. Hver temporal knogledonor gav skriftligt samtykke før døden, eller samtykke blev opnået posthumt fra donorens familie. Se materialetabellen for detaljer om alle materialer, udstyr og software, der bruges i denne protokol.
1. Temporal knoglehøst
- Få godkendelse fra det lokale institutionelle review board (IRB), gennemgå institutionelle politikker for brug af humant og infektiøst materiale, og få samtykke til vævsdonation, før du bruger denne protokol.
- Tag ordentligt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) på, før du arbejder med væv fra COVID-19-positive temporale knogledonorer. Sørg for, at PPE består af en N-95 åndedrætsværn og ansigtsskærm (eller alternativt et luftrensningssystem med positivt tryk), kjole og to par handsker. Gennemgå teknikker til korrekt påklædning og doffing af PPE, inden du begynder denne protokol10.
- Høst tidsmæssigt knoglevæv inden for 12-24 timer efter donordød. Hvis kroppen ikke er nedkølet, skal du sikre dig, at høsten sker inden for 8 timer efter døden.
- Høst temporale knogler under obduktion ved hjælp af fire-snit, blok metode ved osteotom7.
- Efter kraniotomi skal du fjerne hjernen og opdele kraniale nerver til den indre auditive kanal skarpt.
- Lav det første benede snit med osteotomet parallelt med og lige medialt til den pladeformede del af den tidlige knogle.
- Udfør det andet knoglesnit parallelt med det første ved den mediale grænse af den tidlige knogle.
- Derefter laves det tredje snit 3-4 cm anterior og parallelt med petrousryggen.
- Gør det fjerde snit omtrent parallelt med det tredje, 2 cm bageste til petrousryggen.
BEMÆRK: Sørg for, at alle snit strækker sig gennem kraniets base. - Fjern derefter den tidlige knogle ved hjælp af skarp dissektion for at frigøre blødt vævsfastgørelsen langs prøvens nedre kant. Hvis balsamering skal udføres efter temporal knoglehøst, bindes stumpen af halspulsåren.
- Høst temporale knogler under obduktion ved hjælp af fire-snit, blok metode ved osteotom7.
2. Vævsfiksering, afkalkning og sektionering
- Placer straks vævet i 200-300 ml 10% bufferet formalin (formaldehyd), så vævet er helt nedsænket. Lad vævet stå i formaldehyd i mindst 72 timer ved stuetemperatur, og skift opløsningerne dagligt. Opbevar vævet i en lufttæt beholder, og udfør opløsningsændringer under en røghætte, mens du bærer passende PPE for at forhindre virusspredning.
BEMÆRK: Efter fikseringsperioden på 72 timer behøver prøverne ikke længere at blive betragtet som smitsomme. - Brug en præcisionsmikrosav med to diamantklinger til at skære hver prøve i tre "tykke" sektioner for at muliggøre hurtigere vævsafkalkning. Indstil de to diamantklinger til en afstand af 5 mm, så den centrale del af temporalbenet er 5 mm tyk. Sørg for, at vævssektionerne i begge ender er 3-5 mm tykke.
- Anbring de tykke sektioner i 200-300 ml 23% w / w myresyreafkalkningsopløsning i 7-10 dage ved stuetemperatur, indtil vævet er blødt nok til paraffinindlejring. Skift løsningerne dagligt. Kontroller for tilstrækkelig vævsafkalkning ved at palpere prøven, som skal føles blød.
BEMÆRK: Afkalkning kan også verificeres ved røntgen. - Prøverne skylles i rindende postevand i 24 timer ved at anbringe dem i et stort bægerglas under en rindende vandhane.
- Dehydrere vævet i en række alkoholer med stigende koncentration7. Nedsænk vævet i 100-200 ml 70% ethanol i 1,5 time efterfulgt af tre vaske i henholdsvis 95% og 100% ethanol i 1,5 time hver. Vask derefter vævet 3 x 1,5 timer i Xylen.
- Integrer de tykke sektioner i paraffin med fire behandlinger på hver 45 min.
- Brug et kryotom til at skære tynde (10 μm) sektioner. Placer vævet, så vævet skæres i det aksiale plan. Skær tykkere (20 μm) sektioner, hvis det ønskes.
3. Immunhistokemi og billeddannelse
- Hvis der ønskes traditionel hæmatoxylin- og eosinfarvning (ikke beskrevet her), skal du udføre farvning, inden sektionerne monteres på glasglas7.
- Monter sektionerne på positivt ladede glasrutschebaner.
- Bag rutsjebanerne på en kogeplade ved 60 °C i 20 min.
- Placer diasene i en holder og nedsænk dem i en kommerciel forbehandlingsopløsning indeholdende et organisk opløsningsmiddel (diethanolamin i dette tilfælde) og ethanol for at deparaffinisere, rehydrere og afsløre vævet.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at opnå tilfredsstillende resultater med immunohistokemi til formalinfikseret og paraffinindlejret væv. - Varm gliderne i en trykkoger på højt tryk i 20 min.
- Placer diasene i et befugtet kammer og bloker vævet med en kommerciel blokeringsopløsning.
- Undersøg vævssektionerne med det primære antistof mod angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2; 1:50), transmembranprotease serin 2 (TMPRSS2, 1:1.000) og Furin-proteasen (1:250).
BEMÆRK: ACE2-, TMPRSS2- og Furin-antistofferne anvendes, fordi disse proteiner menes at spille en rolle i SARS-CoV-2-infektivitet11,12, og denne protokol forsøgte at undersøge de mulige mekanismer, hvormed SARS-CoV-2 kan inficere mellemøret13. - Behandles med HRP-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (ACE2, Furin; 1:100 fortynding) eller anti-ged (TMPRSS2, 1:100 fortynding) sekundært antistof.
- Modtain diasene med 70% hæmatoxylin i vand.
- Få billeder på et lysmikroskop med et monteret digitalkamera. Få billeder af mellemørets slimhinde og eustakiske rør ved henholdsvis 20x og 10x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hæmatoxylin- og eosinfarvning af mellemørets slimhinde og eustakiske rør viste bevarelse af mellemørets slimhinde og submukosalt mellemørevæv efter behandling (figur 1). Immunohistokemiske billeder viste ekspression af ACE2-, TMPRSS2- og Furinproteinerne i mellemørets slimhinde og eustakiske rør (figur 1). Tilstedeværelsen af disse proteiner i mellemøret giver en mulig rute, hvormed SARS-CoV-2 kan inficere respiratorisk epitel i mellemøret 11,12,13. Endvidere kan ekspressionen af disse proteiner i det eustakiske rør forklare en rute, hvormed virussen kommer ind i mellemøret og rejser til mellemøret fra nasopharynx via det eustakiske rør.
Figur 1: Eksempel på farvet mellemørevæv. Figuren viser hæmatoxylin og eosin, ACE2, TMPRSS2 og Furinfarvning af mellemørets slimhinde (øverste række, 20x forstørrelse) og Eustachian tube (nederste række, 10x forstørrelse). Skalastænger = 50 μm (øverste række); 100 μm (nederste række). Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; angiotensin-konverterende enzym 2; TMPRSS2 = transmembranprotease, serin 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Human temporal knogleforskning er afgørende for at studere indre og mellemørepatologi, men forbliver en tids- og ressourceintensiv indsats. Dette papir beskriver en teknik, der bruger en diamantmikrosav til at generere tykke temporale knoglesektioner, der hurtigt kan afkalkes inden yderligere sektionering, så tiden fra vævshøst til undersøgelse kan reduceres fra 9-10 måneder til 10-14 dage. Denne teknik kan reducere de ressourcer, der kræves til temporal knoglebehandling og lette tidsfølsomme undersøgelser, såsom dem, der er relateret til COVID-19 mellem- og indre ørepatologi13, hvilket var motivationen for at udvikle denne protokol. Denne protokol tillod visualisering af ACE2, TMPRS22 og Furin-ekspression i mellemøret og eustakiske rør, hvilket giver en sandsynlig mekanisme, hvormed SARS-CoV-2 kan inficere mellemøret ved at sprede sig fra nasopharynx gennem det eustakiske rør.
Den primære innovation i denne protokol er brugen af en diamantsav, der skærer vævet før afkalkning, hvilket genererer "tykke" sektioner af temporal knogle, der hurtigt kan afkalkes ved at øge overfladearealet af vævet udsat for afkalkningsmidlet. Dette trin gør det muligt for vævsafkalkning at forekomme inden for 7-10 dage i stedet for de 1-2 måneder, som traditionelle protokoller kan kræve til afkalkning. De "tykke" sektioner af væv, der er skabt med diamantsaven, kan også dehydreres hurtigere end en standardblok af temporalt knoglevæv, hvilket reducerer tiden mellem afkalkning og indlejring. Endvidere anvender denne protokol paraffin som et indlejringsmiddel snarere end celloidin, hvilket tager cirka 3 måneder at hærde7. Mens celloidin giver overlegen bevarelse af cochlea strukturer, hærder paraffin meget hurtigere og letter immunostaining. Med disse modifikationer kan temporalt knoglevæv behandles på 10-14 dage i modsætning til de 9-10 måneder, der kræves i mere traditionelle behandlingsstrategier 7,9.
Denne protokol har flere begrænsninger. Skæring af vævet med diamantsaven før indlejring risikerer at skade Cortis organ (OOC). OOC blev alvorligt beskadiget i de fleste prøver under udviklingen af denne teknik, hvilket kan begrænse værdien af denne teknik til undersøgelse af patologier såsom aldersrelateret høretab, hvor det er afgørende, at de sarte strukturer i det indre øre bevares. Det kan være muligt at placere prøven, så diamantsaven ikke skærer direkte gennem den otiske kapselben og bevarer indre ørestrukturer, men dette forbliver et område med aktiv undersøgelse. Dyremodeller kan være et værdifuldt værktøj til yderligere at forfine denne protokol og øge chancen for at bevare strukturer i det indre øre i disse værdifulde menneskelige prøver. Vævskvaliteten i denne protokol er desuden begrænset af brugen af paraffinindlejringsmidlet, som blev valgt på grund af tidsbegrænsninger. Celloidinindlejring opretholder bedre cellulær integritet i otopatologiske prøver, men tager måneder at hærde7. Endelig kræver denne protokol stadig betydelige tids- og ressourceinvesteringer. Brugen af en diamantmikrosav er en ekstra omkostning for de materialer, der kræves til traditionel temporal knogleforberedelse, og de 7-10 dage, der kræves til afkalkning, er stadig langvarige. I fremtiden kan det være muligt at kombinere disse metoder med mikrobølgeassisteret afkalkning14 for yderligere at forkorte den tid, der kræves til behandling.
På trods af sine begrænsninger tilbyder protokollen til højhastigheds temporal knoglebehandling beskrevet her et andet værktøj til at studere mellemøret og potentielt indre øre, patologi. Denne teknik har været nyttig under COVID-19-pandemien og kan også reducere omkostningerne forbundet med at opretholde et aktivt temporalt knoglelaboratorium ved at reducere den tid og arbejdskraft, der er nødvendig til vævsbehandling. Temporal knogleforskning er faldet i popularitet i USA og faldt fra 28 aktive laboratorier i 1980'erne til kun 4 aktive laboratorier i øjeblikket4. Dette fald i antallet af fungerende temporale knoglelaboratorier kan hænge sammen med de betydelige omkostninger, der er forbundet med høst og forarbejdning af temporale knogler 4,8. Derfor er det vigtigt, at vi sigter mod at udvikle teknikker, der reducerer de ressourcer, der er nødvendige for temporal knoglebehandling, og også dem, der giver mulighed for undersøgelse af temporal knoglepatologi i nye sammenhænge, såsom COVID-19-pandemien. Endvidere kan højhastighedsvævsbehandling, som den, der er skitseret i denne protokol, hjælpe med at anvende nye biologiske teknikker (f.eks. immunhistokemi, transkriptomik), der muliggør vurdering af mellem- og indre ørepatologi på molekylært niveau 15,16,17,18,19 . Vi har næppe ridset overfladen med hensyn til at udnytte molekylære teknikker til at studere humant væv i otologisk sygdom, og de kan give vigtige indsigter, der ikke kan leveres af dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Mohamed Lehar for hans hjælp med dette projekt. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G.
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
- COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al.
- Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
