Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Technik für die schnelle Durchtrennung von menschlichen Schläfenknochen, bei der eine Mikrosäge mit Zwillingsdiamantklingen verwendet wird, um dünne Scheiben für die schnelle Entkalkung und Analyse der Immunhistochemie des Schläfenbeins zu erzeugen.
Abstract
Die histopathologische Analyse von menschlichen Schläfenbeinabschnitten ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie. Schläfenknochenabschnitte werden durch postmortale Temporalknochenernte, Fixierung, Entkalkung, Einbettung und Färbung hergestellt. Aufgrund der Dichte des Schläfenbeins ist die Entkalkung ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess; Die vollständige Gewebepräparation kann durchschnittlich 9-10 Monate dauern. Dies verlangsamt die otopathologische Forschung und behindert zeitkritische Studien, wie sie für die COVID-19-Pandemie relevant sind. Dieses Papier beschreibt eine Technik zur schnellen Vorbereitung und Entkalkung von Schläfenbeinabschnitten, um die Gewebeverarbeitung zu beschleunigen.
Schläfenknochen wurden postmortal mit Standardtechniken geerntet und in 10% Formalin fixiert. Eine Präzisions-Mikrosäge mit zwei Diamantklingen wurde verwendet, um jeden Abschnitt in drei dicke Abschnitte zu schneiden. Dicke Schläfenknochenabschnitte wurden dann 7-10 Tage lang in Entkalkungslösung entkalkt, bevor sie in Paraffin eingebettet, mit einem Kryotom in dünne (10 μm) Abschnitte geschnitten und auf ungeladenen Objektträgern montiert wurden. Anschließend wurden Gewebeproben deparaffinisiert und zur Antikörperfärbung rehydriert (ACE2, TMPRSS2, Furin) und abgebildet. Diese Technik reduzierte die Zeit von der Ernte bis zur Gewebeanalyse von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage. Hochgeschwindigkeits-Schläfenbeinschnitte können die Geschwindigkeit der otopathologischen Forschung erhöhen und die für die Gewebepräparation erforderlichen Ressourcen reduzieren, während gleichzeitig zeitkritische Studien wie die im Zusammenhang mit COVID-19 erleichtert werden.
Introduction
Die Erforschung des menschlichen Temporalknochens bietet eine unschätzbare Ressource, um die Pathologie und Pathophysiologie des Innen- und Mittelohrs zu untersuchen. Vor dem 19. Jahrhundert war wenig über die otologische Erkrankung 1,2,3 bekannt. Um die otologische Erkrankung besser zu verstehen und "die Hörchirurgie aus den Händen von Quacksalbern zu retten", entwickelte Joseph Toynbee (1815-1866) Methoden, um histologische Abschnitte des menschlichen Schläfenbeinszu untersuchen 3. Diese Arbeit wurde von Adam Politzer (1835-1920) in Wien und anderen in ganz Europa während des restlichen 19. Jahrhunderts gefördert, der Schläfenbeinabschnitte verwendete, um die Histopathologie vieler häufiger Erkrankungen des Ohres zu beschreiben 2,3,4.
Das erste Labor für menschliche Schläfenknochen in den Vereinigten Staaten wurde 1927 am Johns Hopkins Hospital eröffnet, wo Stacy Guild (1890-1966) Methoden für die Schläfenbeinschnitte 5,6 entwickelte. Die von Guild entwickelten Methoden bestanden aus einem 9-10-monatigen Prozess, der die postmortale Ernte, Fixierung, Entkalkung in Salpetersäure, Dehydratation in Ethanol, Celloidineinbettung, Schnitt, Färbung und Montage umfasste. Modifikationen an dieser Technik wurden später von Harold Schuknecht (1917-1996)7 vorgenommen; Die Grundkomponenten dieses Prozesses bleiben jedoch im Wesentlichen unverändert.
Die erheblichen Ressourcen, die für die Aufrechterhaltung eines Schläfenbeinlabors erforderlich sind, haben eine Herausforderung für die Schläfenknochenforschung darstellt und wahrscheinlich zu ihrer abnehmenden Popularität in den letzten 30 Jahren beigetragen 4,8. Ein erheblicher Teil der Laborressourcen für Schläfenknochen muss dem 9-10-monatigen Prozess der Schläfenknochenpräparation gewidmet werden. Einer der zeitaufwendigsten Schritte in der Vorbereitung ist die Entkalkung des Schläfenbeins, des dichtesten Knochens im menschlichen Körper. Die Entkalkung wird typischerweise in Salpetersäure oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) durchgeführt und dauert Wochen bis Monate, während ein häufiger Wechsel der Lösungenerforderlich ist 7,9. Darüber hinaus können zeitkritische Studien des menschlichen Ohrs, wie sie sich auf die COVID-19-Pandemie beziehen, durch diesen langsamen Vorbereitungsprozess behindert werden. Dieses Papier beschreibt eine Technik für Hochgeschwindigkeits-Schläfenknochenschnitte, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Abschnitte zu erzeugen, die eine schnelle Entkalkung und Gewebeanalyse innerhalb von 10-14 Tagen nach der Schläfenknochenernte ermöglichen.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde mit der Genehmigung des IRB (IRB00250002) und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem Gewebe und infektiösem Material entwickelt. Jeder Schläfenbeinspender gab vor dem Tod eine schriftliche Zustimmung, oder die Zustimmung wurde posthum von der Familie des Spenders eingeholt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Schläfenbeinernte
- Holen Sie die Genehmigung des lokalen Institutional Review Board (IRB) ein, überprüfen Sie die institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem und infektiösem Material und holen Sie die Zustimmung zur Gewebespende ein, bevor Sie dieses Protokoll verwenden.
- Ziehen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) an, bevor Sie mit Gewebe von COVID-19-positiven Schläfenbeinspendern arbeiten. Stellen Sie sicher, dass die PSA aus einem N-95-Atemschutzgerät und einem Gesichtsschutz (oder alternativ einem Überdruck-Luftreinigungssystem), einem Kittel und zwei Paar Handschuhen besteht. Überprüfen Sie die Techniken zum ordnungsgemäßen An- und Ausziehen von PSA, bevor Sie mit diesem Protokoll10 beginnen.
- Ernten Sie Schläfenbeingewebe innerhalb von 12-24 Stunden nach dem Tod des Spenders. Wenn der Körper nicht gekühlt wird, stellen Sie sicher, dass die Ernte innerhalb von 8 Stunden nach dem Tod erfolgt.
- Ernten Sie Schläfenknochen während der Autopsie mit der Vier-Inzisions-Block-Methode von Osteotom7.
- Entfernen Sie nach der Kraniotomie das Gehirn und teilen Sie die Hirnnerven stark in den inneren Gehörgang auf.
- Machen Sie den ersten knöchernen Schnitt mit dem Osteotom parallel zum und nur medial zum Plattenepithelbereich des Schläfenbeins.
- Führen Sie den zweiten knöchernen Schnitt parallel zum ersten an der medialen Grenze des Schläfenbeins durch.
- Dann machen Sie den dritten Schnitt 3-4 cm vor und parallel zum Petrouskamm.
- Machen Sie den vierten Schnitt ungefähr parallel zum dritten, 2 cm nach dem Petrousgrat.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Einschnitte durch die Schädelbasis reichen. - Entfernen Sie dann den Schläfenbein mit scharfer Dissektion, um den Weichteilansatz entlang der unteren Kante der Probe zu lösen. Wenn die Einbalsamierung nach der Schläfenknochenernte durchgeführt werden soll, binden Sie den Stumpf der Halsschlagader ab.
- Ernten Sie Schläfenknochen während der Autopsie mit der Vier-Inzisions-Block-Methode von Osteotom7.
2. Gewebefixierung, Entkalkung und Schnitt
- Legen Sie das Gewebe sofort in 200-300 ml 10% gepuffertes Formalin (Formaldehyd), so dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Lassen Sie das Gewebe mindestens 72 h bei Raumtemperatur in Formaldehyd und wechseln Sie die Lösungen täglich. Lagern Sie das Gewebe in einem luftdichten Behälter und führen Sie Lösungswechsel unter einem Abzug durch, während Sie geeignete PSA tragen, um eine Ausbreitung des Virus zu verhindern.
HINWEIS: Nach der 72-stündigen Fixierungszeit müssen die Proben nicht mehr als infektiös angesehen werden. - Verwenden Sie eine Präzisionsmikrosäge mit zwei Diamantklingen, um jede Probe in drei "dicke" Abschnitte zu schneiden, um eine schnellere Gewebeentkalkung zu ermöglichen. Stellen Sie die Zwillingsdiamantklingen auf einen Abstand von 5 mm ein, so dass der mittlere Abschnitt des Schläfenbeins 5 mm dick ist. Stellen Sie sicher, dass die Gewebeabschnitte an beiden Enden 3-5 mm dick sind.
- Die dicken Abschnitte in 200-300 ml 23% ohne Ameisensäureentkalkungslösung für 7-10 Tage bei Raumtemperatur geben, bis das Gewebe weich genug für die Paraffineinbettung ist. Ändern Sie die Lösungen täglich. Überprüfen Sie auf eine ausreichende Gewebeentkalkung, indem Sie die Probe abtasten, die sich weich anfühlen sollte.
HINWEIS: Die Entkalkung kann auch durch Röntgenstrahlen verifiziert werden. - Spülen Sie die Proben 24 h lang in fließendem Leitungswasser ab, indem Sie sie in ein großes Becherglas unter einem laufenden Wasserhahn legen.
- Dehydrieren Sie das Gewebe in einer Reihe von Alkoholen mit zunehmender Konzentration7. Tauchen Sie das Gewebe in 100-200 ml 70% Ethanol für 1,5 h ein, gefolgt von drei Wäschen in 95% bzw. 100% Ethanol für jeweils 1,5 h. Als nächstes waschen Sie das Gewebe 3 x 1,5 h in Xylol.
- Betten Sie die dicken Abschnitte in Paraffin ein, mit vier Behandlungen von jeweils 45 Minuten.
- Verwenden Sie ein Kryotom, um dünne (10 μm) Schnitte zu schneiden. Positionieren Sie das Gewebe so, dass das Gewebe in der axialen Ebene geschnitten wird. Schneiden Sie auf Wunsch dickere (20 μm) Abschnitte.
3. Immunhistochemie und Bildgebung
- Wenn eine herkömmliche Hämatoxylin- und Eosinfärbung gewünscht ist (hier nicht beschrieben), führen Sie eine Färbung durch, bevor Sie die Abschnitte auf Glasobjektträgern7 montieren.
- Montieren Sie die Abschnitte auf positiv geladenen Glasobjektträgern.
- Backen Sie die Dias auf einer heißen Platte bei 60 °C für 20 min.
- Legen Sie die Objektträger in einen Halter und tauchen Sie sie in eine kommerzielle Vorbehandlungslösung, die ein organisches Lösungsmittel (in diesem Fall Diethanolamin) und Ethanol enthält, um das Gewebe zu entparaffinisieren, zu rehydrieren und zu entlarven.
HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um zufriedenstellende Ergebnisse mit der Immunhistochemie für formalinfixiertes und paraffineingebettetes Gewebe zu erzielen. - Erhitzen Sie die Objektträger in einem Schnellkochtopf auf Hochdruck für 20 min.
- Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und blockieren Sie das Gewebe mit einer kommerziellen Blockierlösung.
- Sondieren Sie die Gewebeabschnitte mit dem primären Antikörper gegen das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2; 1:50), Transmembran-Protease-Serin 2 (TMPRSS2, 1:1.000) und die Furin-Protease (1:250).
HINWEIS: Die ACE2-, TMPRSS2- und Furin-Antikörper werden verwendet, weil angenommen wird, dass diese Proteine eine Rolle bei der SARS-CoV-2-Infektiosität 11,12 spielen, und dieses Protokoll versuchte, die möglichen Mechanismen zu untersuchen, durch die SARS-CoV-2 das Mittelohrinfizieren kann13. - Behandlung mit HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (ACE2, Furin; 1:100-Verdünnung) oder Anti-Ziegen-Antikörper (TMPRSS2, 1:100-Verdünnung).
- Den Objektträgern mit 70% Hämatoxylin in Wasser entgegenwirken.
- Erfassen Sie Bilder auf einem Lichtmikroskop mit einer montierten Digitalkamera. Erhalten Sie Bilder der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre mit 20-facher bzw. 10-facher Vergrößerung.
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Representative Results
Hämatoxylin- und Eosinfärbungen der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre zeigten nach der Verarbeitung eine Erhaltung der Mittelohrschleimhaut und des submukösen Mittelohrgewebes (Abbildung 1). Immunhistochemische Bilder zeigten die Expression der Proteine ACE2, TMPRSS2 und Furin in der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre (Abbildung 1). Das Vorhandensein dieser Proteine im Mittelohr bietet einen möglichen Weg, auf dem SARS-CoV-2 das respiratorische Epithel im Mittelohr infizieren kann11,12,13. Darüber hinaus kann die Expression dieser Proteine innerhalb der Eustachischen Röhre einen Weg erklären, auf dem das Virus in das Mittelohr gelangt und vom Nasopharynx über die Eustachische Röhre zum Mittelohr gelangt.
Abbildung 1: Beispiel für gefärbtes Mittelohrgewebe. Die Abbildung zeigt Hämatoxylin und Eosin, ACE2, TMPRSS2 und Furin-Färbung der Mittelohrschleimhaut (obere Reihe, 20-fache Vergrößerung) und der Eustachischen Röhre (untere Reihe, 10-fache Vergrößerung). Maßstabsbalken = 50 μm (obere Reihe); 100 μm (untere Reihe). Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; Angiotensin-Converting-Enzym 2; TMPRSS2 = Transmembranprotease, Serin 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Erforschung des menschlichen Schläfenbeins ist für die Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie von entscheidender Bedeutung, bleibt aber ein zeit- und ressourcenintensives Unterfangen. Dieses Papier beschreibt eine Technik, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Schläfenknochenabschnitte zu erzeugen, die vor dem weiteren Schneiden schnell entkalkt werden können, so dass die Zeit von der Gewebeernte bis zur Untersuchung von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage verkürzt werden kann. Diese Technik kann die für die Verarbeitung von Temporalknochen erforderlichen Ressourcen reduzieren und zeitkritische Studien erleichtern, z. B. im Zusammenhang mit der COVID-19-Mittel- und Innenohrpathologie13, die die Motivation für die Entwicklung dieses Protokolls war. Dieses Protokoll ermöglichte die Visualisierung der ACE2-, TMPRS22- und Furinexpression im Mittelohr und in der Eustachischen Röhre, was einen wahrscheinlichen Mechanismus darstellt, durch den SARS-CoV-2 das Mittelohr infizieren kann, indem es sich vom Nasopharynx durch die Eustachische Röhre ausbreitet.
Die Hauptinnovation dieses Protokolls ist die Verwendung einer Diamantsäge, die das Gewebe vor der Entkalkung schneidet, wodurch "dicke" Abschnitte des Schläfenbeins erzeugt werden, die schnell entkalkt werden können, indem die Oberfläche des Gewebes, das dem Entkalkungsmittel ausgesetzt ist, vergrößert wird. Dieser Schritt ermöglicht die Gewebeentkalkung innerhalb von 7-10 Tagen anstelle der 1-2 Monate, die herkömmliche Protokolle für die Entkalkung benötigen. Die mit der Diamantsäge erzeugten "dicken" Gewebeabschnitte können auch schneller dehydriert werden als ein Standardblock aus Schläfenbeingewebe, wodurch die Zeit zwischen Entkalkung und Einbettung verkürzt wird. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll Paraffin als Einbettungsmittel anstelle von Celloidin, das etwa 3 Monate benötigt, um7 auszuhärten. Während Celloidin eine überlegene Erhaltung der Cochlea-Strukturen bietet, härtet Paraffin viel schneller aus und erleichtert die Immunfärbung. Mit diesen Modifikationen kann Schläfenbeingewebe in 10-14 Tagen verarbeitet werden, im Gegensatz zu den 9-10 Monaten, die in traditionelleren Verarbeitungsstrategien erforderlich sind 7,9.
Dieses Protokoll hat mehrere Einschränkungen. Das Schneiden des Gewebes mit der Diamantsäge vor dem Einbetten birgt die Gefahr, dass das Cortiorgan (OOC) beschädigt wird. Das OOC wurde bei den meisten Proben während der Entwicklung dieser Technik schwer beschädigt, was den Wert dieser Technik für die Untersuchung von Pathologien wie altersbedingtem Hörverlust einschränken kann, bei denen es wichtig ist, dass die empfindlichen Strukturen des Innenohrs erhalten bleiben. Es kann möglich sein, die Probe so zu positionieren, dass die Diamantsäge nicht direkt durch den otischen Kapselknochen schneidet und Innenohrstrukturen bewahrt, aber dies bleibt ein Bereich aktiver Untersuchung. Tiermodelle können ein wertvolles Werkzeug sein, um dieses Protokoll weiter zu verfeinern und die Chance zu erhöhen, Innenohrstrukturen in diesen wertvollen menschlichen Exemplaren zu erhalten. Die Gewebequalität in diesem Protokoll wird zusätzlich durch die Verwendung des Paraffin-Einbettungsmittels eingeschränkt, das aus Zeitgründen ausgewählt wurde. Die Celloidin-Einbettung hält die zelluläre Integrität in otopathologischen Proben besser aufrecht, benötigt jedoch Monate, um 7 auszuhärten. Schließlich erfordert dieses Protokoll immer noch erhebliche Zeit- und Ressourceninvestitionen. Die Verwendung einer Diamant-Mikrosäge ist ein zusätzlicher Kostenfaktor für die Materialien, die für die traditionelle Schläfenbeinpräparation benötigt werden, und die 7-10 Tage, die für die Entkalkung erforderlich sind, sind immer noch langwierig. In Zukunft könnte es möglich sein, diese Methoden mit der mikrowellengestützten Entkalkung14 zu kombinieren, um die für die Verarbeitung erforderliche Zeit weiter zu verkürzen.
Trotz seiner Einschränkungen bietet das hier beschriebene Protokoll für die Hochgeschwindigkeits-Schläfenknochenverarbeitung ein weiteres Werkzeug zur Untersuchung der Mittelohr- und möglicherweise Innenohrpathologie. Diese Technik hat sich während der COVID-19-Pandemie als nützlich erwiesen und kann auch die Kosten für die Aufrechterhaltung eines aktiven Schläfenbeinlabors reduzieren, indem sie die Zeit und den Arbeitsaufwand für die Gewebeverarbeitung reduziert. Die Schläfenbeinforschung hat in den Vereinigten Staaten an Popularität verloren und ist von 28 aktiven Laboratorien in den 1980er Jahren auf derzeitnur 4 aktive Laboratorien zurückgegangen. Dieser Rückgang der Zahl der in Betrieb befindlichen Schläfenbeinlabore kann mit den erheblichen Kosten zusammenhängen, die mit der Ernte und Verarbeitung von Schläfenknochen verbunden sind 4,8. Folglich ist es wichtig, dass wir Techniken entwickeln, die die für die Verarbeitung von Temporalknochen erforderlichen Ressourcen reduzieren, und auch solche, die die Untersuchung der Temporalknochenpathologie in neuen Kontexten wie der COVID-19-Pandemie ermöglichen. Darüber hinaus kann die Hochgeschwindigkeits-Gewebeverarbeitung, wie sie in diesem Protokoll beschrieben ist, den Einsatz neuer biologischer Techniken (z. B. Immunhistochemie, Transkriptomik) unterstützen, die die Beurteilung der Mittel- und Innenohrpathologie auf molekularer Ebene ermöglichen 15,16,17,18,19 . Wir haben kaum an der Oberfläche gekratzt, wenn es darum geht, molekulare Techniken zur Untersuchung von menschlichem Gewebe bei otologischen Erkrankungen zu verwenden, und sie können wichtige Erkenntnisse liefern, die Tiermodelle nicht liefern können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Mohamed Lehar für seine Unterstützung bei diesem Projekt. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (T32DC000027, NSA) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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