Summary
In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.
Abstract
Het actinecytoskelet, de belangrijkste mechanische machinerie in de cel, bemiddelt tal van essentiële fysieke cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming, deling, migratie en adhesie. Het bestuderen van de dynamiek en structuur van het actinenetwerk in vivo wordt echter bemoeilijkt door de biochemische en genetische regulatie in levende cellen. Om een minimaal model te bouwen zonder intracellulaire biochemische regulatie, wordt actine ingekapseld in gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, ook wel liposomen genoemd). De biomimetische liposomen zijn celgroot en vergemakkelijken een kwantitatief inzicht in de mechanische en dynamische eigenschappen van het cytoskeletnetwerk, waardoor een levensvatbare route wordt geopend voor bottom-up synthetische biologie. Om liposomen voor inkapseling te genereren, wordt de omgekeerde emulsiemethode (ook wel de emulsieoverdrachtsmethode genoemd) gebruikt, wat een van de meest succesvolle technieken is voor het inkapselen van complexe oplossingen in liposomen om verschillende celnabootsingssystemen voor te bereiden. Met deze methode wordt een mengsel van interessante eiwitten toegevoegd aan de binnenbuffer, die later wordt geëmulgeerd in een fosfolipide-bevattende minerale olieoplossing om monolaagse lipidedruppeltjes te vormen. De gewenste liposomen worden gegenereerd uit monolaagse lipidedruppels die een lipide / olie-water-interface kruisen. Deze methode maakt de inkapseling van geconcentreerde actinepolymeren in de liposomen met gewenste lipidecomponenten mogelijk, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor in vitro reconstitutie van een biomimicking cytoskeletnetwerk.
Introduction
Het actinecytoskelet speelt een fundamentele rol bij het construeren van de intracellulaire architectuur van de cel door contractiliteit op moleculair niveau en krachtgeneratie 1,2,3 te coördineren. Als gevolg hiervan bemiddelt het tal van essentiële cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming 4,5, deling6, migratie 7,8 en adhesie9. De in vitro reconstitutie van actinenetwerken heeft de afgelopen jaren enorme aandacht gekregen 10,11,12,13,14,15,16,17. Het doel van reconstitutie is om een minimaal model van de cel te bouwen zonder de complexe biochemische regulatie die bestaat in levende cellen. Dit biedt een controleerbare omgeving om specifieke intracellulaire activiteiten te onderzoeken en vergemakkelijkt de identificatie en analyse van verschillende componenten van het actinecytoskelet 18,19. Verder biedt de inkapseling van in vitro actinenetwerken in fosfolipide gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, liposomen) een beperkte maar vervormbare ruimte met een semi-permeabele grens. Het bootst de fysiologische en mechanische micro-omgeving van de actinemachinerie na in de cel 9,20,21,22.
Onder verschillende methoden om liposomen te bereiden, is de lipidefilmhydratatiemethode (ook bekend als de zwellingsmethode) een van de vroegste technieken23. De droge lipidefilm hydrateert met de toevoeging van buffers en vormt vliezige bubbels die uiteindelijk blaasjes worden24. Om grotere blaasjes met een hogere opbrengst te produceren, past een verbeterde methode die voortgaat op de filmhydratatiemethode, bekend als de elektroformatiemethode25, een AC elektrisch veld toe om het hydratatieproces efficiënt te bevorderen26. De belangrijkste beperkingen van deze op hydratatie gebaseerde methoden voor actine-inkapseling zijn dat het een lage inkapselingsefficiëntie van sterk geconcentreerde eiwitten heeft en alleen compatibel is met specifieke lipidesamenstellingen24. De omgekeerde emulsietechniek heeft in vergelijking minder beperkingen voor lipidecomponenten en eiwitconcentraties 20,27,28,29. Bij deze methode wordt een mengsel van eiwitten voor inkapseling toegevoegd aan de binnenste waterige buffer, die later wordt geëmulgeerd in een lipidebevattende minerale olieoplossing, waarbij lipide-monolaagdruppeltjes worden gevormd. De monolaagse lipidedruppels kruisen vervolgens door een andere lipide / olie-water-interface door centrifugatie om bilayer lipide blaasjes (liposomen) te vormen. Deze techniek is een van de meest succesvolle strategieën gebleken voor actine-inkapseling24,30. Afzonderlijk zijn er enkele microfluïdische apparaatmethoden, waaronder gepulseerde jetting31,32, transiënte membraanuitwerping33 en de cDICE-methode34. De overeenkomsten tussen de omgekeerde emulsiemethode en de microfluïdische methode zijn het lipideoplosmiddel (olie) dat wordt gebruikt en de introductie van lipide / olie-water-interface voor de vorming van de buitenste folder van liposomen. Daarentegen vereist het genereren van liposomen door de microfluïdische methode een opstelling van microfluïdische apparaten en gaat gepaard met olie die tussen de twee blaadjes van de bilayer is opgesloten, wat een extra stap vereist voor olieverwijdering35.
In dit manuscript gebruikten we de omgekeerde emulsietechniek om liposomen te bereiden die een gepolymeriseerd F-actinenetwerk inkapselen zoals eerder gebruikt22. Het eiwitmengsel voor inkapseling werd eerst in een buffer met niet-polymeriserende omstandigheden geplaatst om actine in zijn bolvormige (G) vorm te behouden. Het hele proces werd uitgevoerd bij 4 °C om vroege actinepolymerisatie te voorkomen, die later werd geactiveerd door het monster te laten opwarmen tot kamertemperatuur. Eenmaal op kamertemperatuur polymeriseert de actine in zijn filamenteuze (F) vorm. Een verscheidenheid aan actinebindende eiwitten kan worden toegevoegd aan de binnenste waterige bufferoplossing om eiwitfunctionaliteiten en -eigenschappen te bestuderen, waardoor verdere inzichten worden verkregen in de interactie met het actinenetwerk en het membraanoppervlak. Deze methode kan ook worden toegepast op de inkapseling van verschillende eiwitten van belang36 en grote objecten (microdeeltjes, zelfrijdende microswimmers, enz.) dicht bij de grootte van de uiteindelijke liposomen28,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van buffers en eiwitoplossingen
- Bereid de waterige Inwendige Niet-Polymerisatiebuffer (INP) in een totaal volume van 5 ml door 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sucrose en 0,2 mM ATP te mengen.
- Bereid de Protein Mix (PM) door eiwitten toe te voegen aan de INP-buffer bij 4 °C met de volgende concentraties: 11,2 μM niet-fluorescerend G-actine, 2,8 μM fluorescerend gelabeld actine en 0,24 μM Arp2/3 (Tabel met materialen). Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 100 nM gelsolin, 4 μM cofiline en 2,2 μM VCA-His toe aan de PM. Vervang PM als controle-experiment door 100 μg/ml fluorescerende kleurstof (materiaaltabel).
- Bereid de waterige binnenpolymerisatiebuffer (IP) (waterig) in een totaal volume van 5 ml door 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP en 80 mM sucrose te mengen.
- Bereid de eindbuffer (FB) voor door inp-buffer (met PM) en IP-buffer te mengen in een volumeverhouding van 1:1 om de binnenste waterige oplossing te verkrijgen in een totaal volume van 30 μL dat in het liposoom wordt ingekapseld.
- Bereid de waterige buitenbuffer (OB) in een totaal volume van 150 μL door 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose en 0,1 mg/ml β-caseïne te mengen.
OPMERKING: De osmolariteit van de OB kan worden aangepast met glucose om ervoor te zorgen dat de osmotische druk van de OB iets groter is dan die van de FB (20-60 mOsm). De dichtheid van de FB moet iets hoger zijn dan de OB.
2. Bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechnieken
- Bereid het lipide-oliemengsel
- Voeg 100 μL 25 mg/ml L-α-fosfatidylcholine (niet-fluorescerend Ei PC, ook wel EPC genoemd, inclusief 1% DHPE) toe aan een glazen injectieflacon. Verdamp chloroform met argongas en laat een droge vaste lipidenfilm (2,5 mg) achter op de bodem van de injectieflacon.
- Om een F-actinelaag te vormen, voegt u 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} nikkelzout (DOGS-NTA-Ni) toe aan een 10:1 verhouding van EPC tot DOGS-NTA-Ni en meng voor de verdamping van chloroform.
- Voeg 2 ml minerale olie toe en soniceer het lipide-oliemengsel bij kamertemperatuur in een bad gedurende 1 uur om de lipiden opnieuw op te schorten.
OPMERKING: Het lipide-oliemengsel na ultrasoonapparaat kan gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. Re-sonicatie wordt voorgesteld voor gebruik.
- Voeg 100 μL 25 mg/ml L-α-fosfatidylcholine (niet-fluorescerend Ei PC, ook wel EPC genoemd, inclusief 1% DHPE) toe aan een glazen injectieflacon. Verdamp chloroform met argongas en laat een droge vaste lipidenfilm (2,5 mg) achter op de bodem van de injectieflacon.
- Bereid een laatste buffer in olie (FB / olie) emulsie voor het bereiden van monolaag lipidedruppels die het eiwit van belang bevatten.
- Voeg aan 100 μL lipide-oliemengsel in een plastic buis 10 μL FB toe. Zorg ervoor dat FB zich in één druppel bevindt.
- Teken met behulp van een glazen spuit het lipide-olie-FB-mengsel en zuig meerdere keren voorzichtig op en neer om het te emulgeren; trek eerst een kleine hoeveelheid lipide-oliemengsel en vervolgens de FB-druppel door de punt van de spuit aan de rand van de druppel te plaatsen om deze in kleine druppeltjes te breken. Herhaal de op en neer gaande aspiratie totdat een witachtige en troebele emulsie wordt gevormd.
- Doe 30 μL OB in een aparte plastic buis. Plaats 30 μL van het lipide-oliemengsel bovenop OB en laat het ~ 10 minuten zitten om een lipide monolaag op het grensvlak te ontwikkelen.
OPMERKING: Als de lipiden geladen zijn of het eiwit wordt opgenomen, moet de duur van deze stap worden verlengd38. - Bereid de liposomen voor
- Voeg voorzichtig 50 μL van de FB/olie-emulsie (stap 2.2) toe aan de bovenste oliefase van de buis vanaf stap 2.3.
- Centrifugeer de plastic buis bij 100 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Varieer de tijd en centrifugatiesnelheid om te optimaliseren voor liposoomvorming.
OPMERKING: Na centrifugatie moet de bovenste oliefase duidelijk zijn en moet de onderste OB (met liposomen) enigszins troebel zijn. - Verwijder de oliefase voorzichtig met een pipet. Aspirateer extra volume indien nodig. Zorg ervoor dat u de pipetpunt niet aan de zijkant van de buis plaatst om te voorkomen dat er een meniscus van olie bovenop de liposoomfase ontstaat.
- Steek met een nieuwe pipet de pipetpunt langzaam in de resterende onderste fase en zuig het waterige volume aan om liposomen te verzamelen.
OPMERKING: Het is beter om volume te verliezen dan om de olie op te nemen. De toevoeging van olie zal ervoor zorgen dat liposomen scheuren en de interne componenten worden vrijgegeven in de externe buffer. Snijd de punt van een pipet om afschuiving te verminderen.
3. Microscopie observatie
- Giet 100 μL OB in de put van een incubatiekamer (4-wells plaat met 12 mm ronde coverslips). Deponeer de verzamelde liposomen (stap 2.4.4) voorzichtig in OB en plaats vervolgens een andere coverslip bovenop de kamer.
OPMERKING: De OB bevat de β-caseïne om het glasoppervlak te passiveren en het plakken tussen de liposomen te minimaliseren20. - Observeer liposomen met een confocale microscoop met behulp van een 63x olie-immersie objectief. Gebruik laserlijnen van 488 nm, 647 nm en 561 nm om respectievelijk fluorescerend gelabeld lipide, ingekapselde fluorescerende kleurstof en ingekapselde fluorescerend gelabelde actine te observeren. Leg de interessante frames vast en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling.
- Verwerk en analyseer afbeeldingen in ImageJ/Fiji39. Voor nieuwe gebruikers van ImageJ/Fiji is een online tutorial beschikbaar (zie Materiaaltabel).
- Open het TIFF-bestand met behulp van ImageJ / Fiji-software.
- Ga naar Afbeelding > > helderheid / contrast aanpassen. Pas de helderheid en het contrast van de afbeelding aan de gewenste schaal aan door de instellingen Minimum en Maximum en de schuifregelaars Helderheid en Contrast aan te passen.
- Klik op het gereedschap Rechthoekselectie in de werkbalk en selecteer het interessante gebied (ROI). Ga naar Afbeelding > bijsnijden om de ROI bij te snijden.
- Ga naar Analyseren > Schaal instellen. Voer in het pop-upvenster 1.0 in het veld Pixelverhouding in en stel μm in als lengte-eenheid. Voer in het veld Afstand in pixels de afbeeldingsbreedte in pixels in. Voer in het veld Bekende afstand de werkelijke afbeeldingsbreedte in micron in.
- Als u de grootte van het liposoom wilt meten, tekent u met het gereedschap Ovaal selecteren in de werkbalk een cirkel langs de rand van het liposoom. Ga naar Analyseren > Meten om het oppervlak van de cirkel te meten, van waaruit de diameter van het liposoom kan worden berekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechniek wordt grafisch en schematisch geïllustreerd in figuur 1.
Eerst werden lege (kale) liposomen (~ 5-50 μm in diameter) bereid die waren samengesteld uit fosfolipide (EPC) en fluorescerend lipide (DHPE). Een heldere, verrode fluorescerende kleurstof werd ingekapseld in kale liposomen als een controle-experiment. Of een lipide monolaag zich met succes heeft gevormd in het perifere deel van de druppel, kan worden bepaald door monolaagse lipidedruppels te observeren die fluorescerende kleurstof in de emulsie bevatten, zoals weergegeven in figuur 2A. Succesvolle liposoomgeneratie kan worden geverifieerd door de visualisatie van de dunne cirkelvormige ring, de groen-fluorescerende lipide bilayer (conjugatie van lipiden met DHPE), onder 488 nm laser met behulp van confocale microscopie (figuur 2A, meest rechts paneel). Om de inkapseling van de fluorescerende kleurstof te bevestigen, moet de interne omgeving van de liposomen uniform fluorescerend zijn onder een laser van 647 nm (figuur 2A; overlaybeeld) vanwege de verrode fluorescerende kleurstof (Tabel van materialen).
Verschillende vormen van ingekapseld actine in de monolaag lipidedruppel zijn weergegeven in figuur 2B. Afbeeldingen van links naar rechts tonen bolvormige actine (G-actine), filamenteuze actine (F-actine), actine die een dunne F-actinelaag vormt met de toevoeging van VCA-His aan de uiteindelijke buffer en nikkellipide aan het membraan, en actine die een dunne F-actinelaag vormt met de toevoeging van VCA-His, cofiline en gelsolin aan de laatste buffer en nikkellipide aan het membraan.
Vervolgens werden gezuiverde G-actine en geassocieerde F-actine bindende eiwitten ingekapseld in het liposoom. Samengesteld uit dezelfde membraancomponenten als hierboven (EPC gemengd met DHPE), waren liposomen hier ~ 5-50 μm in diameter. De vorming van liposomen kan worden gevisualiseerd door de dunne groene cirkelvormige ringen in figuur 3A, B. Actinepolymerisatie werd geactiveerd door het monster te laten opwarmen tot kamertemperatuur. Zoals te zien is in figuur 3A, zijn de gereconstitueerde F-actinenetwerken (met 20% fluorescerend gelabeld actine) in liposomen heterogeen en manifesteren ze zich als vertakte netwerkstructuren van actinefilamenten. De vertakte architectuur werd geactiveerd door de introductie van het Arp2/3-complex, dat tegelijkertijd de nucleatie en vertakking van actinefilamenten regelt, samen met VCA-His 40,41,42,43,44,45.
Ten slotte werd een F-actine cortex-biomimicking systeem gecreëerd. Een dunne, maar dicht vertakte F-actinelaag werd gecreëerd in de binnenste folder van de bilayer van liposomen22, die kon worden gevisualiseerd als een fluorescerende schil (figuur 3C). In dit geval werden bovendien VCA-His, cofilin en gelsolin ingekapseld in liposomen. Nikkellipiden waren vereist in de component van het lipidemembraan. VCA-His, een WASP-fragment, draagt een histidine-tag in interactie met de nikkellipiden van het lipidemembraan. Ondertussen rekruteert het het Arp2/3-complex 20,46,47,48. Als gevolg hiervan genereert actine nucleated door het Arp2/3-complex een F-actinelaag gecoat langs de binnenste laag van het membraan in aanwezigheid van cofilin en gelsolin.
Figuur 1: Bereiding van liposomen op basis van de omgekeerde emulsietechniek. (A) Liposoompreparaat bestaat uit twee stappen. Stap één: Een druppel van 10 μL Final Buffer (FB) met interessante eiwitten werd toegevoegd aan 100 μL van het fosfolipide-oliemengsel in een verhouding van 1:10 en gesuspendeerd door voorzichtig op en neer te zuigen met een glazen spuit. Oplossingen die monolaagse lipidedruppeltjes bevatten, werden witachtig na de heen-en-weer-aspiratie. Stap twee: In een aparte plastic buis werden een paar microliter van het lipide-oliemengsel bovenop dezelfde hoeveelheid OB geplaatst en mochten ze ~ 10 minuten zitten om een lipide monolaag te ontwikkelen op OB / olie-interface. De emulsie van stap één werd vanaf stap twee bovenop de oliefase gegoten en werd gecentrifugeerd (100 x g; 15 minuten) bij 4 °C. Na centrifugatie moet de bovenste olie-oplossing helder zijn en de onderste OB-oplossing (die liposomen bevat) enigszins troebel zijn. (B) Schema's van het liposoompreparaat van een omgekeerde emulsie. De witachtige emulsie aan de bovenkant bevatte monolaagse lipidedruppeltjes die een vertakt actinenetwerk bevatten. Tijdens de centrifugatie passeerden monolaagse lipidedruppels de OB / olie-interface om een buitenste folder te vormen, zodat liposomen werden gemaakt en zich ophoopten aan de onderkant van de plastic buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microscopische beelden van de monolaag lipidedruppel. (A) De monolaag lipidedruppel met fluorescerende kleurstof in de emulsie. Afbeeldingen van links naar rechts tonen een monolaag lipidedruppel onder het DIC-kanaal, fluorescerend 640 nm-kanaal, overlay van het DIC- en 640 nm-kanaal en fluorescerend 488 nm-kanaal. (B) Verschillende vormen van ingekapseld actine in de monolaag lipidedruppel onder een fluorescerend 561 nm-kanaal. Afbeeldingen van links naar rechts tonen bolvormige actine (G-actine), filamenteuze actine (F-actine), actine die een dunne F-actinelaag vormt met de toevoeging van VCA-His aan de laatste buffer en nikkellipide aan het membraan, en actine die een dunne F-actinelaag vormt met de toevoeging van VCA-His, cofiline en gelsolin aan de laatste buffer en nikkellipide aan het membraan. Schaalbalken zijn 10 μm bij 63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microscopische beelden van de inkapseling van actinenetwerken in liposomen. (A) Een liposoom dat gepolymeriseerd vertakt (Arp 2/3 nucleated) F-actinenetwerk inkapselt. Van links naar rechts: fluorescerend 488 nm-kanaal (links), fluorescerend 561 nm-kanaal (midden), overlay (rechts). (B) Een representatief resultaat van suspensies van liposomen die gepolymeriseerde vertakte (Arp 2/3 nucleated) F-actinenetwerken inkapselen. Van links naar rechts: fluorescerend 488 nm-kanaal (links), fluorescerend 561 nm-kanaal (midden) en overlay (rechts). (C) Het verschijnen van de vorming van een dunne maar dichte F-actinelaag gecoat langs de binnenste laag van het lipidemembraan van een liposoom. Van boven naar beneden: fluorescerend 488 nm kanaal (boven), fluorescerend 561 nm kanaal (midden), overlay (onder). Schaalbalken zijn 10 μm bij 63x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende belangrijke stappen bepalen het succes van een hoge opbrengst van liposomen tijdens het bereidingsproces. Om de lipidefilm in de olie volledig op te lossen, moet het monster worden gesoniseerd totdat de lipidefilm op de bodem van de glazen injectieflacon volledig verdwijnt. Na de ultrasoonapparaat moet het lipide-oliemengsel 's nachts bij kamertemperatuur onder donkere omstandigheden worden bewaard om de lipidemoleculen verder te laten dispergeren29. Het mengsel kan maximaal een week bij 4 °C worden bewaard. Bij het bereiden van een FB/olie-emulsie met monolaagse lipidedruppeltjes die een interessant eiwit bevatten, moet het lipide-olie-FB-mengsel voorzichtig heen en weer worden gepompt door een glazen spuit om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd. Tijdens dit proces wordt één grote druppel aan de punt van de glazen spuit afgeschoren in vele kleinere druppeltjes (~ 5-100 μm in diameter) na verschillende herhalingen. Het mengsel moet na het proces witachtig zijn30. Om de kwaliteit van fosfolipiden te controleren en of zich met succes een lipidemonolaag had gevormd in het perifere deel van de FB-druppel, werden monolaaglipidedruppels met fluorescerende kleurstof onderzocht in de emulsie, zoals weergegeven in figuur 2A. Om de passage van de monolaag lipidedruppels door de OB / olie-interface tijdens centrifugatie te garanderen en de verzamelde liposomen in OB op het glasoppervlak te laten bezinken, moet de dichtheid van FB iets hoger zijn dan de OB. Daarom werden sucrose en glucose gekozen als hoofdbestanddeel van respectievelijk de binnenste (FB) en buitenste (OB) waterige oplossingen. In het vorige werk werd dextran gebruikt om de dichtheid van de binnenste waterige oplossing20 aan te passen, die niet in dit protocol is opgenomen. Bovendien werd de osmolariteit van de OB aangepast met glucose, zodat de osmotische druk van de OB iets groter is dan die van FB (20-60 mOsm) zoals gerapporteerd in het vorige werk20,22. Groot osmolariteitsverschil leidde tot de krimp (wanneer de osmolariteit van de OB groter is dan die van FB) of breuk (wanneer de osmolariteit van de FB groter is dan die van OB) van de liposomen. Een osmometer werd gebruikt om de osmolariteiten van de buffers te controleren. In het protocol werd β-caseïne toegevoegd in de OB om zowel plastic buisoppervlakken als glazen oppervlakken van de beeldkamer te passiveren en het plakken tussen de liposomente minimaliseren 20,49. Minerale olie werd gebruikt als de olie-oplossing (d.w.z. het lipide oplosmiddel). Verschillende lipide oplosmiddelen zijn elders gemeld, waaronder dodecaan50, vloeibare paraffine30, squalaan51, enz. Dienovereenkomstig worden verschillende centrifugatiesnelheden en -duur gebruikt voor verschillende lipide-oplosmiddelen vanwege hun viscositeitsverschillen en de invloed die ze hebben op de liposoom oppervlaktespanning. De duur van stap 2.3 moet worden verlengd voor geladen lipiden omdat deze geladen moleculen elkaar in de monolaag afstoten, waardoor er meer tijd nodig is om te diffunderen en goed te organiseren op het grensvlak tussen het lipide/ oliemengsel en OB38. Voor lipiden die zijn opgenomen met interessante eiwitten, wordt ook een uitbreiding van deze stap aanbevolen om een betere monolaagvorming te garanderen52. Voor de liposoomopbrengst van liposomen die het gepolymeriseerde F-actinenetwerk inkapselen, is het aantal liposomen per gezichtsveld (100 μm x 100 μm) ongeveer 5-10 met een gemiddelde diameter van 20 μm. Een uitgezoomd beeld van een typisch microscopiemonster is weergegeven in figuur 3B. Meer uitgezoomde confocale beelden van de liposomen geproduceerd door de omgekeerde emulsiemethode zijn te vinden in een recente studie52 waar verschillende parameters (dichtheidsverschil, centrifugatiesnelheid / tijd, lipideconcentratie, pH, temperatuur, enz.) zijn geoptimaliseerd voor de productie van liposomen met een hoog rendement.
Voor de reconstitutie van het F-actinenetwerk is het essentieel om een geschikte concentratie van het adenosinetrifosfaat (ATP), dithiothreitol (DTT), de bijbehorende zouten en de pH-conditie te kiezen. Een tussentijds controlepunt van het gereconstitueerde F-actinenetwerk kan worden gedaan door monolaagse lipidedruppels met ingekapselde actine erin te observeren. Verschillende vormen van ingekapseld actine in de monolaag lipidedruppel zijn weergegeven in figuur 2B. Actinepolymerisatie vindt plaats bij >20 mM K+ zout en in >0,2 mM Mg2+ zout met de pH gestabiliseerd tussen 6,5 en 8,5, zoals eerder gemeld 53,54,55. Vóór de beeldvorming van liposomen werden alle oplossingen op ijs gehouden om vroege actinepolymerisatie te voorkomen. De monsters werden bij kamertemperatuur in beeld gebracht om actinepolymerisatie te activeren. De architectuur van het gereconstitueerde F-actinenetwerk wordt voornamelijk gereguleerd door de activiteit van het Arp2/3-complex. Het Arp 2/3-complex nucleates en takken actinefilamenten van de zijkant van een bestaand moederfilament om dendritische architecturen te genereren56,57. De Nikkel-lipide (DOGS-NTA-Ni) en de VCA-His zijn cruciaal voor de vorming van de F-actinelaag. VCA-His dient als een nucleatiebevorderende factor, die is gekoppeld aan nikkellipiden op het membraan22,58. Een vertakt F-actinenetwerk wordt vervolgens gekerneld vanuit VCA-His dat het Arp2/3-complex faciliteert, en als gevolg daarvan wordt een dichte F-actineschil gevormd aan de binnenste folder van het lipidemembraan. De concentratie van VCA-His binnen het liposoom bepaalt de dikte van de F-actinelaag. De toevoeging van de actine regulerende eiwitten (cofilin en gelsolin) bevordert ook de vorming van de F-actinelaag. De cofilin breekt actinefilamenten om het aantal filamentuiteinden te vergroten, terwijl de gelsolin zich bindt aan de prikkeldraaduiteinden van actinefilamenten om hun groei te beperken. Daardoor kan, in aanwezigheid van cofiline en gelsolin, een groter aantal filamenten worden gekernneld door Arp2/3, en vervolgens door VCA-His worden gerekruteerd om de F-actinelaag te vormen.
Vergelijkbare artikelen op basis van de emulsietransfermethode voor eiwitinkapseling zijn de afgelopen jaren gepubliceerd 28,30,34. Een groot verschil tussen het protocol hier en de protocollen in deze artikelen is de keuze van het primaire lipide voor liposomen. In dit werk gebruiken we de L-α-fosfatidylcholine (EPC, een mengsel van verschillende fosfatidylcholinesoorten met ongeveer 60% POPC59) als hoofdbestanddeel van het liposoommembraan. Om een F-actinelaag te vormen, werd een mengsel van de EPC en het nikkellipide (DOGS-NTA-Ni) gebruikt in een verhouding van 10: 1. In een eerder werk werden liposomen verspreid op polyhistidine gecoat glas en EPC, cholesterol en nikkellipide werden gemengd in een verhouding van 53: 37: 1020. Ter vergelijking: Natsume et al. en Bashirzadeh et al. kozen voor de dioleoylfosfocholine (DOPC, een enkel type fosfolipide) om respectievelijk microsferen28 en fascin-actinebundels34 in te kapselen, terwijl Fujii et al. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC, een zuiver synthetisch fosfolipide) aanbevalen als het primaire lipide om een op liposomen gebaseerde membraaneiwitsynthesetechnologie vast te stellen30 . De keuze van de primaire lipiden beïnvloedt de fysieke eigenschappen van liposomen. Naarmate bijvoorbeeld de mate van onverzadiging van de acylketen toeneemt (d.w.z. POPC< EPC< DOPC60), nemen de permeabiliteitseigenschappen van verschillende moleculen door de bilayer af61. De keuze hangt ook af van het feit of de lipiden van belang worden gemengd. De toevoeging van het cholesterol maakt bijvoorbeeld EPC-liposomen stabieler, terwijl het de dubbellaagse structuur van DOPC / DOPE-mengsel61 destabiliseert.
De overeenkomsten tussen dit werk en een recente publicatie van Bashirzadeh et al.34 vallen over hetzelfde onderwerp van actine-inkapseling. Ondertussen zijn er duidelijke verschillen. Bashirzadeh et al. rapporteerden een aangepaste cDICE-benadering met behulp van een 3D-geprinte roterende kamer. Hier passen we de eenvoudige, traditionele omgekeerde emulsie-overdrachtsmethode toe met behulp van een spuit en een centrifugemachine. Beide methoden genereren een hoge opbrengst van liposomen en hebben een hoge inkapselingsefficiëntie voor grote biomoleculen24. Naast het verschil in de lipidecomponenten zoals hierboven vermeld, veranderen ook de architecturen van het ingekapselde actinenetwerk. Bashirzadeh et al. ingekapselde fascin-actinebundels binnen het liposoom, terwijl we in dit werk een vertakt netwerk inkapselden dat werd geactiveerd door het Arp2/3-complex. Daarnaast is hier de vorming van een F-actinelaag uitgewerkt om een cortex-biomimicking systeem te creëren in aanwezigheid van VCA-His.
De hier gerapporteerde methode heeft twee beperkingen. Een daarvan is dat de grootte van de liposomen die in vitro gereconstitueerde actinenetwerken bevatten, niet precies kan worden gemanipuleerd (variërend van 5 tot 50 μm in diameter) en de opbrengst is laag in vergelijking met de elektroformatiemethode. De andere beperking van een methode op basis van waterolie is dat sporenhoeveelheden olie tussen de dubbellaagse blaadjes worden opgesloten24. Hoewel het de membraandikte of de biocompatibiliteit van deze bio-nabootsende liposomen24,35,62,63 niet significant beïnvloedt, kan de membraandynamiek van de in olie ingebrachte liposomen worden gewijzigd62. In deze methode wordt de actine-nucleator Arp2/3 opgenomen. Toekomstige studies kunnen andere cytoskeleteiwitten 64,65,66,67, nucleators, zoals formin 68, of moleculaire motoren zoals myosine II69 omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We erkennen de financiering van ARO MURI W911NF-14-1-0403 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 en Human Frontiers Science Program (HFSP) subsidienummer RGY0073/2018 aan M.P.M. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de ARO, NIH of HFSP. S.C. erkent vruchtbare gesprekken met V. Yadav, C. Muresan en S. Amiri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Nickel Lipid |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802-25G | DABCO |
| Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AKL99-D | non-fluorescent G-actin |
| Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AR05 | fluorescently labeled actin |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383-10G | ATP |
| Alexa Fluor 647 dye | ThermoFisher | fluorescent dye | |
| Andor iQ3 | Andor Technologies | control and acquisition software for confocal microscope | |
| Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain | Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 10035048 | CaCl2 |
| Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) | Quorum Technologies | incubation chamber | |
| Cofilin protein: human recombinant | Cytoskeleton, Inc | CF01-C | cofilin |
| Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
| D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA | Sigma | G7528 | glucose |
| Dithiothreitol | DOT Scientific | DSD11000-10 | DTT |
| Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant | Cytoskeleton, Inc | HPG6 | gelsolin |
| Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip | Cole-Parmer | UX-07940-53 | glass syringe |
| HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
| ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
| L-alpha-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | EPC |
| Magnesium chloride | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | Sigma | 8042475 | mineral oil |
| N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) | VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests | ||
| Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
| Potassium chloride | Sigma | 7447407 | KCl |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | sucrose |
| β-Casein from bovine milk | Sigma | C6905-250MG |
References
- Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L.
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
- Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Bray, D., White, J.
- Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
- Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
- Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
- Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R.
- Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
- Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
- Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
- Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
- Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
- Murrell, M., et al.
- Liu, A. P., et al.
- Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
- Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
- Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
- Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
- Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
- Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
- Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
- Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
- Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
- Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
- Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
- Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A.
- Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
- Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
- Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
- Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
- Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
- Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
- Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T.
- Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
- Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
- Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
- Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
- Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
- Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).
