Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Rekonstitution av aktincytoskeletten inuti gigantiska unilamellära vesiklar

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

I detta manuskript demonstrerar vi de experimentella teknikerna för att kapsla in F-aktincytoskelettet i gigantiska unilamellära lipidblåsor (även kallade liposomer) och metoden för att bilda ett cortex-biohärmande F-aktinskikt vid liposommembranets inre broschyr.

Abstract

Aktincytoskelettet, det huvudsakliga mekaniska maskineriet i cellen, förmedlar många väsentliga fysiska cellulära aktiviteter, inklusive celldeformation, delning, migration och vidhäftning. Att studera dynamiken och strukturen i aktinnätverket in vivo kompliceras dock av den biokemiska och genetiska regleringen i levande celler. För att bygga en minimal modell utan intracellulär biokemisk reglering är aktin inkapslat inuti gigantiska unilamellära vesiklar (GUVs, även kallade liposomer). De biomimetiska liposomerna är cellstora och underlättar en kvantitativ inblick i cytoskelettnätverkets mekaniska och dynamiska egenskaper, vilket öppnar en livskraftig väg för syntetisk biologi nedifrån och upp. För att generera liposomer för inkapsling används den inverterade emulsionsmetoden (även kallad emulsionsöverföringsmetoden), som är en av de mest framgångsrika teknikerna för att kapsla in komplexa lösningar i liposomer för att förbereda olika cellliknande system. Med denna metod tillsätts en blandning av proteiner av intresse till den inre bufferten, som senare emulgeras i en fosfolipidinnehållande mineraloljelösning för att bilda monolager lipiddroppar. De önskade liposomerna genereras från monolager lipiddroppar som passerar ett lipid / olje-vattengränssnitt. Denna metod möjliggör inkapsling av koncentrerade aktinpolymerer i liposomerna med önskade lipidkomponenter, vilket banar väg för in vitro-rekonstituering av ett biohärmande cytoskelettnätverk.

Introduction

Aktincytoskelettet spelar en grundläggande roll för att konstruera cellens intracellulära arkitektur genom att samordna kontraktilitet på molekylär nivå och kraftgenerering 1,2,3. Som ett resultat förmedlar den många viktiga cellulära aktiviteter, inklusive celldeformation4,5, division6, migration 7,8 och vidhäftning9. In vitro-rekonstitueringen av aktinnätverk har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren 10,11,12,13,14,15,16,17. Målet med rekonstituering är att bygga en minimal modell av cellen utan den komplexa biokemiska reglering som finns i levande celler. Detta erbjuder en kontrollerbar miljö för att undersöka specifika intracellulära aktiviteter och underlättar identifiering och analys av olika komponenter i aktincytoskelettet18,19. Vidare ger inkapslingen av in vitro-aktinnätverk inuti fosfolipidjätte unilamellära vesiklar (GUVs, liposomer) ett begränsat men deformerbart utrymme med en halvgenomsläpplig gräns. Det efterliknar den fysiologiska och mekaniska mikromiljön hos aktinmaskineriet i cellen 9,20,21,22.

Bland olika metoder för att förbereda liposomer är lipidfilmhydratiseringsmetoden (även känd som svullnadsmetoden) en av de tidigaste teknikerna23. Den torra lipidfilmen hydratiseras med tillsats av buffertar och bildar membranösa bubblor som så småningom blir vesiklar24. För att producera större vesiklar med högre utbyte tillämpar en förbättrad metod som går vidare från filmhydratiseringsmetoden, känd som elektroformationsmetoden25, ett elektriskt växelströmsfält för att effektivt främja hydreringsprocessen26. De största begränsningarna med dessa hydratiseringsbaserade metoder för aktinkapsling är att den har låg inkapslingseffektivitet hos högkoncentrerade proteiner, och den är endast kompatibel med specifika lipidkompositioner24. Den inverterade emulsionstekniken har i jämförelse färre begränsningar för lipidkomponenter och proteinkoncentrationer20,27,28,29. I denna metod tillsätts en blandning av proteiner för inkapsling till den inre vattenhaltiga bufferten, som senare emulgeras i en lipidinnehållande mineraloljelösning och bildar lipid-monolagerdroppar. Monolayer lipiddropparna passerar sedan genom ett annat lipid / olje-vattengränssnitt genom centrifugering för att bilda dubbelskiktiga lipidblåsor (liposomer). Denna teknik har visat sig vara en av de mest framgångsrika strategierna för aktinkapsling24,30. Separat finns det några mikrofluidiska anordningsmetoder, inklusive pulserad jetting 31,32, övergående membranutkastning33 och cDICE-metoden34. Likheterna mellan den inverterade emulsionsmetoden och den mikrofluidiska metoden är lipidlösningsmedlet (olja) som används och införandet av lipid / olje-vattengränssnitt för bildandet av liposomernas yttre bipacksedel. Däremot kräver genereringen av liposomer med den mikrofluidiska metoden en uppsättning mikrofluidiska anordningar och åtföljs av olja som fångas mellan de två broschyrerna i dubbelskiktet, vilket kräver ett extra steg för oljeavlägsnande35.

I detta manuskript använde vi den inverterade emulsionstekniken för att förbereda liposomer som inkapslar ett polymeriserat F-aktinnätverk som tidigare använts22. Proteinblandningen för inkapsling placerades först i en buffert med icke-polymeriserande betingelser för att bibehålla aktin i sin globulära (G) form. Hela processen utfördes vid 4 °C för att förhindra tidig aktinpolymerisation, som senare utlöstes genom att låta provet värmas till rumstemperatur. En gång vid rumstemperatur polymeriseras aktinet till sin trådformiga (F). En mängd olika aktinbindande proteiner kan tillsättas till den inre vattenhaltiga buffertlösningen för att studera proteinfunktioner och egenskaper, vilket ytterligare ger insikter om dess interaktion med aktinnätverket och membranytan. Denna metod kan också tillämpas på inkapsling av olika proteiner av intresse36 och stora föremål (mikropartiklar, självgående mikroswimmers, etc.) nära storleken på de slutliga liposomerna 28,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av buffertar och proteinlösningar

  1. Förbered den vattenhaltiga inre icke-polymerisationsbufferten (INP) i en total volym på 5 ml genom att blanda 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sackaros och0,2 mM ATP.
  2. Förbered proteinblandningen (PM) genom att tillsätta proteiner till INP-bufferten vid 4 °C med följande koncentrationer: 11,2 μM icke-fluorescerande G-aktin, 2,8 μM fluorescerande märkt aktin och 0,24 μM Arp2/3 (Materialtabell). För att bilda ett F-aktinskikt, tillsätt 100 nM gelsolin, 4 μM cofilin och 2,2 μM VCA-His till PM. Som ett kontrollexperiment, ersätt PM med 100 μg / ml fluorescerande färgämne (materialtabell).
  3. Förbered den vattenhaltiga inre polymerisationsbufferten (vattenhaltig) i en total volym på 5 ml genom att blanda 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP och 80 mM sackaros.
  4. Förbered den slutliga bufferten (FB) genom att blanda INP-buffert (innehållande PM) och IP-buffert i ett volymförhållande på 1:1 för att ge den inre vattenlösningen i en total volym på 30 μl som kommer att kapslas in i liposomen.
  5. Bered den vattenhaltiga utomhusbufferten (OB) i en total volym på 150 μl genom att blanda 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glukos och 0,1 mg/ml β-kasein.
    OBS: OB: OB: s osmolaritet kan justeras med glukos för att säkerställa att OB: s osmotiska tryck är något större än FB (20-60 mOsm). FB: s densitet bör vara något högre än OB.

2. Beredning av liposomer baserade på inverterade emulsionstekniker

  1. Förbered lipid-oljeblandningen
    1. Tillsätt 100 μl 25 mg/ml L-α-fosfatidylkolin (icke-fluorescerande ägg-PC, även kallad EPC, inklusive 1% DHPE) i en injektionsflaska av glas. Indunsta kloroform med argongas och lämna en torr fast lipidfilm (2,5 mg) i botten av injektionsflaskan.
      1. För att bilda ett F-aktinskikt, tillsätt 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-karboxypentyl) iminodiättiksyra] succinyl} nickelsalt (DOGS-NTA-Ni) i förhållandet 10:1 mellan EPC och DOGS-NTA-Ni och blanda före avdunstning av kloroform.
    2. Tillsätt 2 ml mineralolja och sonika lipid-oljeblandningen vid rumstemperatur i ett bad i 1 h för att åter suspendera lipiderna.
      OBS: Lipid-oljeblandningen efter ultraljudsbehandling kan hållas i 1 vecka vid 4 °C. Ultraljudsbehandling föreslås före användning.
  2. Förbered en slutlig buffert i oljeemulsion (FB / olja) för beredning av lipiddroppar i monolager som innehåller proteinet av intresse.
    1. Till 100 μL lipid-oljeblandning som tas i ett plaströr, tillsätt 10 μL FB. Se till att FB är i en droppe.
    2. Använd en glasspruta och dra lipid-olja-FB-blandningen och aspirera försiktigt upp och ner flera gånger för att emulgera den; dra först en liten mängd lipid-oljeblandning och sedan FB-droppen genom att placera sprutans spets i droppens periferi för att bryta upp den i små droppar. Upprepa upp och ner aspirationen tills en vitaktig och grumlig emulsion bildas.
  3. Sätt 30 μL OB i ett separat plaströr. Placera 30 μL av lipid-oljeblandningen ovanpå OB och låt den sitta i ~ 10 minuter för att utveckla ett lipidmonolager vid gränssnittet.
    OBS: Om lipiderna laddas eller proteinet införlivas, bör varaktigheten av detta steg förlängas38.
  4. Förbered liposomerna
    1. Tillsätt försiktigt 50 μl av FB/oljeemulsionen (steg 2.2) till rörets övre oljefas från steg 2.3.
    2. Centrifugera plaströret vid 100 x g i 15 minuter vid 4 °C. Variera tid och centrifugeringshastighet för att optimera för liposombildning.
      OBS: Efter centrifugering bör den övre oljefasen vara klar och den nedre OB (som innehåller liposomer) ska vara något grumlig.
    3. Ta försiktigt bort oljefasen med pipett. Aspirera extra volym om det behövs. Se till att inte sätta pipettspetsen vid sidan av röret för att undvika att skapa en menisk av olja ovanpå liposomfasen.
    4. Med en ny pipett sticker du långsamt pipettspetsen i den återstående bottenfasen och aspirerar vattenvolymen för att samla liposomer.
      OBS: Det är bättre att förlora volymen än att införliva oljan. Införandet av olja kommer att orsaka liposomer att brista, och de inre komponenterna kommer att släppas ut i den externa bufferten. Skär spetsen på en pipett för att minska skjuvningen.

3. Mikroskopiobservation

  1. Häll 100 μL OB i brunnen i en inkubationskammare (4-brunnsplatta innehållande 12 mm runda täckblad). Sätt försiktigt in de uppsamlade liposomerna (steg 2.4.4) i OB och placera sedan en annan täckskiva ovanpå kammaren.
    OBS: OB innehåller β-kasein för att passivera glasytan och minimera klibbning mellan liposomerna20.
  2. Observera liposomer med ett konfokalmikroskop med hjälp av ett 63x oljedoppningsmål. Använd 488 nm, 647 nm och 561 nm laserlinjer för att observera fluorescerande märkt lipid, inkapslat fluorescerande färgämne respektive inkapslat fluorescerande märkt aktin. Fånga ramarna av intresse och spara bilderna i TIFF-format.
  3. Bearbeta och analysera bilder i ImageJ/Fiji39. För nya användare av ImageJ/Fiji finns en onlinehandledning tillgänglig (se Materialförteckning).
    1. Öppna TIFF-filen med programvaran ImageJ/Fiji.
    2. Gå till Bild > Justera > ljusstyrka / kontrast. Justera bildens ljusstyrka och kontrast till önskad skala genom att justera inställningarna Minimum och Maximum samt skjutreglagen Ljusstyrka och Kontrast .
    3. Klicka på rektangelvalsverktyget i verktygsfältet och välj intresseområde (ROI). Gå till Bild > beskär för att beskära avkastningen.
    4. Gå till Analysera > inställd skala. I popup-fönstret anger du 1.0 i fältet Pixelproportioner och ställer in μm som längdenhet. I fältet Avstånd i pixlar anger du bildbredden i pixlar . I fältet Känt avstånd anger du den verkliga bildbredden i mikron.
    5. Om du vill mäta liposomens storlek använder du det ovala markeringsverktyget i verktygsfältet och ritar en cirkel längs liposomens kant. Gå till Analysera > Mät för att mäta cirkelns yta, från vilken liposomens diameter kan beräknas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beredningen av liposomer baserat på den inverterade emulsionstekniken illustreras grafiskt och schematiskt i figur 1.

Först framställdes tomma (nakna) liposomer (~ 5-50 μm i diameter) som bestod av fosfolipid (EPC) och fluorescerande lipid (DHPE). Ett ljust, långt rött fluorescerande färgämne kapslades in i nakna liposomer som ett kontrollexperiment. Huruvida ett lipidmonolager framgångsrikt har bildats i droppens perifera kan bestämmas genom att observera monolager lipiddroppar som innehåller fluorescerande färgämne i emulsionen, som visas i figur 2A. Framgångsrik liposomgenerering kan verifieras genom visualisering av den tunna cirkulära ringen, som är det grönfluorescerande lipid-dubbelskiktet (konjugering av lipider med DHPE), under 488 nm laser med konfokalmikroskopi (figur 2A, höger panel). För att bekräfta inkapsling av det fluorescerande färgämnet bör liposomernas inre miljö vara jämnt fluorescerande under en 647 nm laser (figur 2A; överlagringsbild) på grund av det fjärrröda fluorescerande färgämnet (materialtabell).

Olika former av inkapslat aktin inuti monoskiktets lipiddroppe visas i figur 2B. Bilder från vänster till höger visar globulärt aktin (G-aktin), trådformigt aktin (F-aktin), aktin som bildar ett tunt F-aktinskikt med tillsats av VCA-His till den slutliga bufferten och nickel-lipid till membranet och aktin som bildar ett tunt F-aktinskikt med tillsats av VCA-His, cofilin och gelsolin till den slutliga bufferten och nickel-lipid till membranet.

Därefter kapslades renat G-aktin och tillhörande F-aktinbindande proteiner in i liposomen. Består av samma membrankomponenter som ovan (EPC blandat med DHPE), liposomer här var ~ 5-50 μm i diameter. Bildandet av liposomer kunde visualiseras av de tunna gröna cirkulära ringarna som visas i figur 3A,B. Aktinpolymerisation utlöstes genom att låta provet värmas till rumstemperatur. Som visas i figur 3A är de rekonstituerade F-aktinnätverken (med 20% fluorescerande märkt aktin) inuti liposomer heterogena och manifesterar sig som grenade nätverksstrukturer av aktinfilament. Den grenade arkitekturen utlöstes av introduktionen av Arp2/3-komplexet, som samtidigt styr kärnbildning och förgrening av aktinfilament, tillsammans med VCA-His 40,41,42,43,44,45.

Slutligen skapades ett F-aktin cortex-biomimicking-system. Ett tunt, men tätt grenat F-aktinskikt skapades vid den inre broschyren av dubbelskiktet av liposomer22, som kunde visualiseras som ett fluorescerande skal (figur 3C). I detta fall kapslades dessutom VCA-His, cofilin och gelsolin in i liposomer. Nickel-lipider krävdes i komponenten i lipidmembranet. VCA-His, ett WASP-fragment, bär en histidintagg i interaktion med nickel-lipiderna i lipidmembranet. Under tiden rekryterar den Arp2/3-komplexet 20,46,47,48. Som ett resultat genererar aktinkärna av Arp2/3-komplexet ett F-aktinskikt belagt längs membranets inre skikt i närvaro av cofilin och gelsolin.

Figure 1
Figur 1: Beredning av liposomer baserat på inverterad emulsionsteknik. (A) Liposomberedning består av två steg. Steg ett: En droppe av 10 μL slutlig buffert (FB) som bär proteiner av intresse tillsattes till 100 μL av fosfolipidoljeblandningen i ett förhållande av 1:10 och suspenderades genom att försiktigt aspirera upp och ner med en glasspruta. Lösningar som innehöll lipiddroppar i monolager blev vitaktiga efter strävan fram och tillbaka. Steg två: I ett separat plaströr placerades några mikroliter av lipid-oljeblandningen ovanpå samma mängd OB och fick sitta i ~ 10 minuter för att utveckla ett lipidmonolager vid OB / oljegränssnitt. Emulsionen från steg ett hälldes ovanpå oljefasen från steg två och centrifugerades (100 x g; 15 minuter) vid 4 °C. Efter centrifugering ska den övre oljelösningen vara klar och den nedre OB-lösningen (innehållande liposomer) ska vara något grumlig. B) Scheman över liposompreparatet från en inverterad emulsion. Den vitaktiga emulsionen på toppen innehöll lipiddroppar i monolager som införlivade ett grenat aktinnätverk inuti. Under centrifugeringen passerade lipiddroppar i monolager genom OB/oljegränssnittet för att bilda en yttre bipacksedel så att liposomer skapades och ackumulerades i botten av plaströret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopiska bilder av lipiddroppen i monolager. (A) Monolager lipiddroppen som innehåller fluorescerande färgämne i emulsionen. Bilder från vänster till höger visar en lipiddroppe i ett lager under DIC-kanalen, fluorescerande 640 nm-kanal, överlagring av DIC- och 640 nm-kanalen respektive fluorescerande 488 nm-kanal. (B) Olika former av inkapslat aktin inuti monolagerlipiddroppen under en fluorescerande 561 nm-kanal. Bilder från vänster till höger visar globulärt aktin (G-aktin), trådformigt aktin (F-aktin), aktin som bildar ett tunt F-aktinskikt med tillsats av VCA-His till den slutliga bufferten och nickel-lipid till membranet och aktin som bildar ett tunt F-aktinskikt med tillsats av VCA-His, cofilin och gelsolin till den slutliga bufferten och nickel-lipid till membranet. Skalstänger är 10 μm vid 63x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Mikroskopiska bilder av inkapslingen av aktinnätverk inuti liposomer. (A) Ett liposominkapslande polymeriserat grenat (Arp 2/3 kärnfullt) F-aktinnätverk. Från vänster till höger: fluorescerande 488 nm kanal (vänster), fluorescerande 561 nm kanal (mitten), överlägg (höger). (B) Ett representativt resultat av suspensioner av liposomer som inkapslar polymeriserade grenade (Arp 2/3 kärnbildade) F-aktinnät. Från vänster till höger: fluorescerande 488 nm kanal (vänster), fluorescerande 561 nm kanal (mitten) och överlägg (höger). (C) Utseendet på bildandet av ett tunt men tätt F-aktinskikt belagt längs det inre skiktet av lipidmembranet i en liposom. Uppifrån och ner: fluorescerande 488 nm kanal (överst), fluorescerande 561 nm kanal (centrum), överlägg (botten). Skalstänger är 10 μm vid 63x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera viktiga steg avgör framgången för ett högt utbyte av liposomer under beredningsprocessen. För att helt lösa upp lipidfilmen i oljan måste provet sonikeras tills lipidfilmen i botten av glasflaskan försvinner helt. Efter ultraljudsbehandling, lipid-olja blandningen måste lagras över natten vid rumstemperatur under mörka förhållanden för lipidmolekylerna att sprida ytterligare29. Blandningen kan förvaras vid 4 °C i upp till en vecka. Vid beredning av en FB/oljeemulsion med lipiddroppar i monolager som innehåller protein av intresse måste lipid-olja-FB-blandningen försiktigt pumpas fram och tillbaka genom en glasspruta för att undvika att luftbubblor förs in. Under denna process klipps en stor droppe av vid spetsen av glassprutan i många mindre droppar (~ 5-100 μm i diameter) efter flera repetitioner. Blandningen måste vara vitaktig efter processen30. För att kontrollera kvaliteten på fosfolipider och huruvida ett lipidmonolager framgångsrikt hade bildats i periferin av den FB-innehållande droppen, undersöktes monolagerlipiddroppar som innehåller fluorescerande färgämne i emulsionen, som visas i figur 2A. För att säkerställa att lipiddropparna i monolager passerar genom OB/oljegränssnittet under centrifugeringen och låter de uppsamlade liposomerna i OB sätta sig på glasytan, bör FB-densiteten vara något högre än OB. Därför valdes sackaros och glukos som huvudkomponent i de inre (FB) respektive yttre (OB) vattenhaltiga lösningarna. I det tidigare arbetet användes dextran för att justera densiteten hos den inre vattenhaltiga lösningen20, som inte ingår i detta protokoll. Dessutom justerades osmolariteten hos OB med glukos så att det osmotiska trycket hos OB är något större än FB (20-60 mOsm) som rapporterats i föregående arbete20,22. Stor osmolaritetsskillnad ledde till krympning (när osmolariteten hos OB är större än FB) eller bristning (när FB: s osmolaritet är större än OB) hos liposomerna. En osmometer användes för att kontrollera buffertarnas osmolariteter. I protokollet tillsattes β-kasein i OB för att passivera både plaströrsytor och glasytor i bildkammaren och minimera klibbning mellan liposomerna20,49. Mineralolja användes som oljelösning (dvs lipidlösningsmedlet). Olika lipidlösningsmedel har rapporterats någon annanstans, inklusive dodekan 50, flytande paraffin30, squalane51, etc. Följaktligen används olika centrifugeringshastigheter och varaktigheter för olika lipidlösningsmedel på grund av deras viskositetsskillnader och det inflytande de ger på liposomytans spänning. Varaktigheten av steg 2.3 måste förlängas för laddade lipider eftersom dessa laddade molekyler i monolagret stöter bort varandra, vilket kräver mer tid att diffundera och organisera sig väl vid gränssnittet mellan lipid / oljeblandningen och OB38. För lipider införlivade med proteiner av intresse rekommenderas också en förlängning av detta steg för att säkerställa bättre monolagerbildning52. För liposomutbytet av liposomer som inkapslar polymeriserat F-aktinnätverk är antalet liposomer per synfält (100 μm x 100 μm) cirka 5-10 med en medeldiameter på 20 μm. En utzoomad bild av ett typiskt mikroskopiprov visas i figur 3B. Mer utzoomade konfokala bilder av liposomerna som produceras genom den inverterade emulsionsmetoden finns i en nyligen genomförd studie52 där olika parametrar (densitetsskillnad, centrifugeringshastighet / tid, lipidkoncentration, pH, temperatur etc.) har optimerats för högavkastningsproduktion av liposomer.

För rekonstituering av F-aktinnätverket är det viktigt att välja en lämplig koncentration av adenosintrifosfat (ATP), ditiotreitol (DTT), tillhörande salter och pH-tillstånd. En mellanliggande kontrollpunkt för det rekonstituerade F-aktinnätverket kan göras genom att observera lipiddroppar med monolager med inkapslat aktin inuti. Olika former av inkapslat aktin inuti monoskiktets lipiddroppe visas i figur 2B. Aktinpolymerisation sker vid >20 mM K+ salt och i >0,2 mM Mg2+ salt med pH stabiliserat mellan 6,5 och 8,5, som tidigare rapporterats53,54,55. Före avbildning av liposomer hölls alla lösningar på is för att förhindra tidig aktinpolymerisation. Proverna avbildades vid rumstemperatur för att utlösa aktinpolymerisation. Arkitekturen i det rekonstituerade F-aktinnätverket regleras huvudsakligen av aktiviteten i Arp2/3-komplexet. Arp 2/3 komplexa nukleater och grenar aktinfilament från sidan av ett befintligt moderfilament för att generera dendritiska arkitekturer56,57. Nickel-lipiden (DOGS-NTA-Ni) och VCA-His är avgörande för bildandet av F-aktinskiktet. VCA-His fungerar som en kärnbildningsfrämjande faktor, som är kopplad till nickel-lipider vid membranet22,58. Ett grenat F-aktinnätverk kärnas sedan från VCA-His som underlättar Arp2/3-komplexet, och som ett resultat bildas ett tätt F-aktinskal vid lipidmembranets inre broschyr. Koncentrationen av VCA-His inom liposomen bestämmer tjockleken på F-aktinskiktet. Tillsatsen av de aktinreglerande proteinerna (cofilin och gelsolin) främjar också bildandet av F-aktinskiktet. Cofilin severs aktinfilament för att öka antalet filamentändar, medan gelsolin binder till de taggiga ändarna av aktinfilament för att begränsa deras tillväxt. Därmed, i närvaro av cofilin och gelsolin, kan ett större antal filament kärnas av Arp2/3 och sedan rekryteras av VCA-His för att bilda F-aktinskiktet.

Liknande artiklar baserade på emulsionsöverföringsmetoden för proteininkapsling har publicerats under de senaste åren 28,30,34. En stor skillnad mellan protokollet här och protokollen i dessa papper är valet av den primära lipiden för liposomer. I detta arbete använder vi L-α-fosfatidylkolin (EPC, en blandning av olika fosfatidylkolinarter som innehåller cirka 60% POPC59) som huvudkomponent i liposommembranet. För att bilda ett F-aktinskikt användes en blandning av EPC och nickel-lipiden (DOGS-NTA-Ni) i förhållandet 10:1. I ett tidigare arbete spreds liposomer på polyhistidinbelagt glas, och EPC, kolesterol och nickel-lipid blandades i förhållandet 53:37:1020. och Bashirzadeh et al. valde dioleoyl-fosfokolin (DOPC, en enda typ av fosfolipid) för att kapsla in mikrosfärer28 respektive fascin-aktinbuntar34, medan Fujii et al. rekommenderade 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC, en ren syntetisk fosfolipid) som den primära lipiden för att upprätta en liposombaserad membranproteinsyntesteknik30 . Valet av de primära lipiderna påverkar liposomernas fysikaliska egenskaper. Till exempel, när graden av omättnad av acylkedjan ökar (dvs POPC< EPC< DOPC60), minskar permeabilitetsegenskaperna hos olika molekyler genom dubbelskiktet61. Valet beror också på att lipiderna av intresse blandas. Till exempel gör tillsatsen av kolesterolet EPC-liposomer mer stabila, medan det destabiliserar dubbelskiktsstrukturen för DOPC / DOPE-blandning61.

Likheterna mellan detta arbete och en ny publikation från Bashirzadeh et al.34 faller på samma ämne av aktinkapsling. Samtidigt finns det tydliga skillnader. rapporterade en modifierad cDICE-metod med hjälp av en 3D-tryckt roterande kammare. Här antar vi den enkla, traditionella inverterade emulsionsöverföringsmetoden med en spruta och en centrifugmaskin. Båda dessa två metoder genererar ett högt utbyte av liposomer och har hög inkapslingseffektivitet för stora biomolekyler24. Förutom skillnaden i lipidkomponenterna som nämnts ovan förändras också arkitekturerna i det inkapslade aktinnätverket. inkapslade fascin-aktinbuntar i liposomen, medan vi i detta arbete inkapslade ett grenat nätverk utlöst av Arp2/3-komplexet. Dessutom har bildandet av ett F-aktinskikt för att skapa ett cortex-biomimicking-system i närvaro VCA-His utarbetats här.

Metoden som redovisas här har två begränsningar. En är att storleken på liposomerna som innehåller in vitro-rekonstituerade aktinnätverk inte kan manipuleras exakt (varierande från 5 till 50 μm i diameter), och utbytet är lågt jämfört med elektroformationsmetoden. Den andra begränsningen med en vattenoljebaserad metod är att spårmängder av olja fångas mellan bilagerbladen24. Även om det inte signifikant påverkar membrantjockleken eller biokompatibiliteten hos dessa biohärmande liposomer 24,35,62,63, kan membrandynamiken hos de oljeinförda liposomerna förändras 62. I denna metod införlivas aktinnukleatorn Arp2/3. Framtida studier kan inkludera andra cytoskelettproteiner 64,65,66,67, nukleatorer, såsom formin 68, eller molekylära motorer såsom myosin II69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi erkänner finansiering av ARO MURI W911NF-14-1-0403 till M.P.M., National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 till M.P.M., National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 och Human Frontiers Science Program (HFSP) bidragsnummer RGY0073/2018 till M.P.M. Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis ARO: s, NIH: s eller HFSP: s åsikter. S.C. erkänner givande diskussioner med V. Yadav, C. Muresan och S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

Bioengineering utgåva 186
<em>In vitro</em> Rekonstitution av aktincytoskeletten inuti gigantiska unilamellära vesiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter