ब्लैक-लेग्ड टिक में जीन संपादन के लिए भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल टिक भ्रूण को इंजेक्ट करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। ट्रांसजेनिक लाइनों को उत्पन्न करने के लिए आनुवंशिक हेरफेर के लिए भ्रूण इंजेक्शन पसंदीदा तकनीक है।
Abstract
टिक विभिन्न वायरल, बैक्टीरियल और प्रोटोजोआ रोगजनकों को प्रसारित कर सकते हैं और इसलिए उन्हें चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर माना जाता है। टिक-जनित रोगों के बढ़ते बोझ के बावजूद, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान के लिए कार्यात्मक अध्ययन के लिए आनुवंशिक परिवर्तन उपकरणों को लागू करने में चुनौतियों के कारण टिक्स पर शोध कीट रोग वैक्टर से पिछड़ गया है। मच्छर जनित बीमारियों को कम करने के लिए आनुवंशिक हस्तक्षेप ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। हालांकि, इस तरह के हस्तक्षेप के विकास के लिए भ्रूण को इंजेक्ट करके स्थिर जर्मलाइन परिवर्तन की आवश्यकता होती है। इस तरह के भ्रूण इंजेक्शन तकनीक में टिक्स सहित कोलिसेरेट की कमी है। कई कारक, जैसे कि टिक भ्रूण पर एक बाहरी मोटी मोम परत, हार्ड कोरियन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव, कुछ बाधाएं हैं जो पहले टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकास को रोकती थीं। वर्तमान काम ने इन बाधाओं को दूर कर दिया है, और काले पैर वाले टिक के लिए एक भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, यहां वर्णित है। इस तकनीक का उपयोग स्थिर जर्मलाइन परिवर्तनों के लिए CRISPR / Cas9 जैसे घटकों को वितरित करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
टिक चिकित्सा और पशु चिकित्सा महत्व के वैक्टर हैं, जो विभिन्न प्रकार के वायरल, बैक्टीरियल, प्रोटोजोआ रोगजनकों और नेमाटोड 1,2 को प्रसारित करने में सक्षम हैं। पूर्वी संयुक्त राज्य अमेरिका में, काले पैर वाला टिक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस, लाइम रोग (एलडी) रोगज़नक़, स्पाइरोकेट बोरेलिया बर्गडोरफेरी का एक महत्वपूर्ण वेक्टर है। संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल एलडी के 400,000 से अधिक मामले सामने आते हैं, जिससे यह अमेरिका में शीर्ष वेक्टर जनित संक्रामक रोगबन जाता है। बी. बर्गडोरफेरी के अलावा, छह अन्य सूक्ष्मजीव आई. स्कैपुलरिस द्वारा प्रेषित होते हैं- जिनमें चार बैक्टीरिया (एनाप्लाज्मा फागोसाइटोफिलम, बी. मायोनी, बी. मियामोटोई, और एर्लिचिया म्यूरिस यूक्लेरेंसिस), एक प्रोटोजोआ परजीवी (बेबेसिया माइक्रोटी), और एक वायरस (पोवासन वायरस) शामिल हैं, जिससे यह टिक प्रजाति एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय बनजाती है। . जबकि हाल के वर्षों में टिक-जनित रोग अधिक प्रचलित हो गए हैं, टिक्स पर शोध अन्य आर्थ्रोपोड वैक्टर, जैसे मच्छरों के पीछे गिर गया है, टिक्स के अद्वितीय जीव विज्ञान और आनुवंशिक और कार्यात्मक जीनोमिक टूल 4,5 को लागू करने से जुड़ी चुनौतियों के कारण।
जीन-संपादन तकनीक, विशेष रूप से CRISPR / Cas9, ने अब गैर-मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन को संभव बना दिया है। एक जीव में आनुवांशिक उत्परिवर्तन बनाने के लिए, भ्रूण इंजेक्शन जर्मलाइन 6,7,8,9 को बदलने के लिए निर्माण देने के लिए पसंदीदा तरीका बना हुआ है। हालांकि, हाल ही में4 तक, टिक अंडे को भ्रूण10,11 को मारने के बिना इंजेक्शन के लिए बहुत मुश्किल या असंभव माना जाता था। अंडे पर एक मोटी मोम परत, कठोर कोरियोन, और उच्च इंट्रा-अंडाकार दबाव कुछ मुख्य बाधाएं थीं जो टिक्स में भ्रूण इंजेक्शन को रोकती थीं। स्कैपुलारिस 3-4 सप्ताह (लगभग100 अंडे / दिन) में 2,000 अंडे तक का एक क्लच जमा करता है। अंडे अकेले रखे जाते हैं, और प्रत्येक अंडे को मोम के साथ लेपित किया जाता है जो मां के ग्रंथियों के अंग 13,14,15 के प्रोट्रूशियंस या “सींग” द्वारा स्रावित होता है। यह मोम अंडे को निर्जलीकरण से बचाता है और इसमें रोगाणुरोधी यौगिकहोते हैं। टिक अंडे को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए, मोम की परत को हटाना, कोरियन को नरम करना और इंट्राओवल दबाव को कम करने के लिए अंडे को डिसिकेट करना महत्वपूर्ण है ताकि इंजेक्शन अपरिवर्तनीय रूप से अंडे को नुकसान न पहुंचाए। सफल जर्मलाइन परिवर्तन के लिए भ्रूण इंजेक्शन के महत्वपूर्ण महत्व को समझते हुए, आई स्कैपुलारिस के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, जिसका उपयोग सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 निर्माण देने और स्थिर जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न करनेके लिए किया जा सकता है। स्कैपुलारिस अनुसंधान में इसके योगदान के अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य टिक प्रजातियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रारंभिक टिक भ्रूण को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए विकसित पहला प्रोटोकॉल है। ~ 4% -8% की जीवित रहने की दर हासिल की गई है, जो अन्य अच्छी तरह से स्थापित कीट मॉडल 5 में भ्रूण इंजेक्शनके बराबर है?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्रोटोकॉल विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान अंतर्दृष्टि और समर्थन के लिए चन्ना अलुविहारे और योनस गेबरमाइकेल, आईटीएफ, यूएमडी को स्वीकार करते हैं। टंगस्टन सुइयों डेविड ओ’ब्रोचटा, आईटीएफ, यूएमडी से एक उदार उपहार थे। हम आई रिसिनस में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए डॉ लादिस्लाव सिमो के आभारी हैं। इस परियोजना को एनआईएच-एनआईएआईडी आर 21 एआई 128393 और प्लायमाउथ हिल फाउंडेशन, एनवाई से एमजी-एन, नेवादा विश्वविद्यालय से एएन तक स्टार्टअप फंड, एमजी-एन और एएन के लिए नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट नंबर 2019609 और आईजीटीआरसीएन से एएस तक पीयर-टू-पीयर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
