تقنية حقن الأجنة لتحرير الجينات في القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة لحقن أجنة القراد. حقن الأجنة هو الأسلوب المفضل للتلاعب الجيني لتوليد خطوط معدلة وراثيا.
Abstract
يمكن للقراد أن ينقل العديد من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والأولية ، وبالتالي يعتبر ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية. على الرغم من العبء المتزايد للأمراض التي تنقلها القراد ، فقد تخلفت الأبحاث على القراد عن ناقلات الأمراض الحشرية بسبب التحديات في تطبيق أدوات التحول الجيني للدراسات الوظيفية على البيولوجيا الفريدة للقراد. تحظى التدخلات الجينية بالاهتمام للحد من الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك ، فإن تطوير مثل هذه التدخلات يتطلب تحولا مستقرا للخط الجرثومي عن طريق حقن الأجنة. مثل هذه التقنية لحقن الجنين غير موجودة في chelicerates ، بما في ذلك القراد. هناك عدة عوامل ، مثل طبقة الشمع السميكة الخارجية على أجنة القراد ، والمشيمية الصلبة ، والضغط العالي داخل البيضاوي ، هي بعض العقبات التي منعت سابقا تطور بروتوكول حقن الأجنة في القراد. لقد تغلب العمل الحالي على هذه العقبات ، ويتم وصف تقنية حقن الأجنة للقراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، هنا. يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل المكونات ، مثل CRISPR / Cas9 ، لتحويلات الخط الجرثومي المستقرة.
Introduction
القراد هي ناقلات ذات أهمية طبية وبيطرية ، قادرة على نقل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والبروتوزوان والديدان الخيطية1،2. في شرق الولايات المتحدة ، يعد القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis ، ناقلا مهما لمرض لايم (LD) الممرض ، اللولبي Borrelia burgdorferi. يتم الإبلاغ عن أكثر من 400000 حالة من LD كل عام في الولايات المتحدة ، مما يجعلها أكبر الأمراض المعدية المنقولة بالنواقل في الولايات المتحدة1. بالإضافة إلى B. burgdorferi ، تنتقل ستة كائنات دقيقة أخرى بواسطة I. scapularis – بما في ذلك أربعة بكتيريا (Anaplasma phagocytophilum و B. mayonii و B. miyamotoi و Ehrlichia muris eauclarensis) ، وطفيلي أولي واحد (Babesia microti) ، وفيروس واحد (فيروس Powassan) ، مما يجعل هذا النوع من القراد مصدر قلق كبيرللصحة العامة 3 . في حين أن الأمراض التي تنقلها القراد أصبحت أكثر انتشارا في السنوات الأخيرة ، فقد تراجعت الأبحاث على القراد عن ناقلات المفصليات الأخرى ، مثل البعوض ، بسبب البيولوجيا الفريدة للقراد والتحديات المرتبطة بتطبيق الأدوات الجينومية الجينية والوظيفية 4,5.
وقد جعلت تقنيات تحرير الجينات، وخاصة كريسبر/كاس9، الآن دراسات الجينوم الوظيفي ممكنة في الكائنات غير النموذجية. لإنشاء طفرات وراثية في الكائن الحي ، يظل حقن الجنين هو الطريقة المفضلة لتقديم تركيبات لتغيير الخط الجرثومي6،7،8،9. ومع ذلك ، حتى وقت قريب4 ، كان بيض القراد يعتبر صعبا للغاية أو حتى مستحيلا للحقن دون قتل الجنين10,11. كانت طبقة الشمع السميكة على البيض ، والمشيمية الصلبة ، والضغط العالي داخل البيضاوي بعض العقبات الرئيسية التي منعت حقن الجنين في القراد. يودع الكتفي البالغ الذي يتغذى على الدم مخلبا واحدا يصل إلى 2000 بيضة12 على مدار 3-4 أسابيع (حوالي 100 بيضة / يوم). يتم وضع البيض منفردا ، ويتم تغليف كل بيضة بالشمع الذي يفرزه نتوءات أو “قرون” عضو Gené الغدي13،14،15 من الأم. يحمي هذا الشمع البيض من الجفاف ويحتوي على مركبات مضادة للميكروبات15. لحقن بيض القراد بنجاح ، من المهم إزالة طبقة الشمع ، وتليين المشيم ، وتجفيف البيض لتقليل الضغط داخل البيضاوي حتى لا يؤدي الحقن إلى إتلاف البويضة بشكل لا رجعة فيه. فهم الأهمية الحاسمة لحقن الأجنة لنجاح تحويل الخط الجرثومي ، تم تطوير بروتوكول ل I. scapularis ، والذي يمكن استخدامه لتقديم بنية CRISPR / Cas9 وتوليد طفرات جرثومية مستقرة4. بالإضافة إلى مساهمته في أبحاث I. scapularis ، يمكن أيضا تحسين هذا البروتوكول لأنواع القراد الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا هو البروتوكول الأول الذي تم تطويره لحقن أجنة القراد المبكرة بنجاح. تم تحقيق معدل البقاء على قيد الحياة ~ 4٪ -8٪ ، وهو ما يمكن مقارنته بحقن الجنين في نماذج الحشرات الراسخةالأخرى 5.
نظرا لأن هذا هو البروتوكول الأولي ، فمن المتوقع أن يتم تحسين هذا البروتوكول وتخص?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون ب Channa Aluvihare و Youns Gebermicale، ITF، UMD، للحصول على البصيرة والدعم خلال المرحلة الأولية من تطوير البروتوكول. كانت إبر التنغستن هدية سخية من ديفيد أوبروشتا، الITF، UMD. نحن ممتنون للدكتور لاديسلاف سيمو لاختبار هذا البروتوكول في I. ricinus وللمناقشات الثاقبة. تم تمويل هذا المشروع من قبل NIH-NIAID R21AI128393 ومؤسسة بليموث هيل ، نيويورك إلى MG-N ، وصناديق بدء التشغيل من جامعة نيفادا إلى AN، ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم رقم 2019609 إلى MG-N و AN، ومنحة نظير إلى نظير من IGTRCN إلى AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
