Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis
Summary
Настоящий протокол описывает метод инъекции эмбрионов клещей. Инъекция эмбриона является предпочтительным методом генетических манипуляций для создания трансгенных линий.
Abstract
Клещи могут передавать различные вирусные, бактериальные и простейшие патогены и поэтому считаются векторами медицинского и ветеринарного значения. Несмотря на растущее бремя клещевых заболеваний, исследования клещей отстают от переносчиков болезней насекомых из-за проблем с применением инструментов генетической трансформации для функциональных исследований уникальной биологии клещей. Генетические вмешательства привлекают внимание к сокращению заболеваний, переносимых комарами. Однако разработка таких вмешательств требует стабильной трансформации зародышевой линии путем инъекции эмбрионов. Такая техника инъекции эмбриона отсутствует для хелицератов, в том числе клещей. Несколько факторов, таких как внешний толстый слой воска на эмбрионах клещей, твердый хорион и высокое внутриовальное давление, являются некоторыми препятствиями, которые ранее препятствовали развитию протокола инъекции эмбриона у клещей. Настоящая работа преодолела эти препятствия, и здесь описана техника инъекции эмбриона для черноногого клеща, Ixodes scapularis . Этот метод может быть использован для доставки компонентов, таких как CRISPR / Cas9, для стабильных преобразований зародышевой линии.
Introduction
Клещи являются переносчиками медицинского и ветеринарного значения, способными передавать различные вирусные, бактериальные, простейшие патогены и нематоды 1,2. В восточной части Соединенных Штатов черноногий клещ, Ixodes scapularis, является важным переносчиком патогена болезни Лайма (LD), спирохеты Borrelia burgdorferi. Более 400 000 случаев ЛД регистрируются каждый год в Соединенных Штатах, что делает его главным трансмиссивным инфекционным заболеванием в США1. В дополнение к B. burgdorferi, шесть других микроорганизмов передаются I. scapularis, включая четыре бактерии (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi и Ehrlichia muris eauclarensis), один простейший паразит (Babesia microti) и один вирус (вирус Powassan), что делает этот вид клещей серьезной проблемой общественного здравоохранения3 . В то время как клещевые заболевания стали более распространенными в последние годы, исследования клещей отстали от других переносчиков членистоногих, таких как комары, из-за уникальной биологии клещей и проблем, связанных с применением генетических и функциональных геномных инструментов 4,5.
Методы редактирования генов, в частности CRISPR/Cas9, в настоящее время сделали возможными исследования функциональной геномики на немодельных организмах. Для создания наследственных мутаций в организме инъекция эмбриона остается предпочтительным методом доставки конструкций для изменения зародышевой линии 6,7,8,9. Однако до недавнеговремени 4 яйца клещей считались слишком сложными или даже невозможными для инъекции, не убивая эмбрион10,11. Толстый слой воска на яйцах, твердый хорион и высокое внутриовальное давление были одними из основных препятствий, которые препятствовали инъекции эмбриона клещам. Взрослые, питающиеся кровью I. scapularis откладывают одну кладку до 2000 яиц12 в течение 3-4 недель (примерно 100 яиц в день). Яйца откладываются поодиночке, и каждое яйцо покрывается воском, который выделяется выпячиванием или «рогами» железистого органа Гене 13,14,15 матери. Этот воск защищает яйца от высыхания и содержит антимикробные соединения15. Чтобы успешно ввести яйца клещей, важно удалить слой воска, смягчить хорион и высушить яйцеклетки, чтобы уменьшить внутриовальное давление, чтобы инъекция необратимо не повредила яйцеклетку. Понимая критическую важность инъекций эмбрионов для успешной трансформации зародышевой линии, разработан протокол для I. scapularis, который может быть использован для создания конструкции CRISPR / Cas9 и генерации стабильных мутаций зародышевой линии4. В дополнение к его вкладу в исследования I. scapularis, этот протокол также может быть оптимизирован для других видов клещей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это первый протокол, разработанный для успешного введения ранних эмбрионов клещей. Была достигнута выживаемость ~4%-8%, что сопоставимо с инъекцией эмбриона в других хорошо зарекомендовавших себя моделях насекомых5.
Поскольку это первоначальный протокол, ожи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Чанне Алувихаре и Йонусу Гебермикале, ITF, UMD, за понимание и поддержку на начальном этапе разработки протокола. Вольфрамовые иглы были щедрым подарком от Дэвида О’Брохты, ITF, UMD. Мы благодарны доктору Ладиславу Симо за тестирование этого протокола на I. ricinus и за проницательные дискуссии. Этот проект финансировался NIH-NIAID R21AI128393 и Plymouth Hill Foundation, NY to MG-N, стартовыми фондами от Университета Невады до AN, грантом Национального научного фонда No 2019609 MG-N и AN и грантом Peer-to-Peer от IGTRCN до AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
