검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골
Summary
본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.
Abstract
진드기는 다양한 바이러스, 박테리아 및 원생동물 병원체를 전염시킬 수 있으므로 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터로 간주됩니다. 진드기 매개 질병의 부담이 커지고 있음에도 불구하고 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학에 기능 연구를 위한 유전자 변형 도구를 적용하는 데 어려움이 있기 때문에 곤충 질병 벡터에 뒤쳐져 있습니다. 모기 매개 질병을 줄이기 위해 유전 적 개입이 주목 받고 있습니다. 그러나 이러한 개입의 개발에는 배아 주입에 의한 안정적인 생식선 변형이 필요합니다. 이러한 배아 주입 기술은 진드기를 포함한 킬리 세레이트에 부족합니다. 진드기 배아의 외부 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력과 같은 몇 가지 요인은 이전에 진드기에서 배아 주입 프로토콜 개발을 방해했던 몇 가지 장애물입니다. 현재의 연구는 이러한 장애물을 극복했으며 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis 에 대한 배아 주입 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 안정적인 생식계열 변형을 위해 CRISPR/Cas9와 같은 구성 요소를 전달하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
틱은 다양한 바이러스, 박테리아, 원생 동물 병원체 및 선충류 1,2를 전염시킬 수있는 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터입니다. 미국 동부에서 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis는 라임 병 (LD) 병원체 인 스피로 헤테 보렐 리아 부르그 도르 페리의 중요한 매개체입니다. 미국에서 매년 400,000건 이상의 LD 사례가 보고되어 미국에서 가장 많이 매개체 매개 전염병이 되었습니다1. B. burgdorferi 외에도 4 개의 박테리아 (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi 및 Ehrlichia muris eauclarensis), 1 개의 원생 동물 기생충 (Babesia microti) 및 1 개의 바이러스 (Powassan 바이러스)를 포함하여 6 개의 다른 미생물이 견갑골에 의해 전염되어이 진드기 종을 주요 공중 보건 문제로 만듭니다3 . 최근 몇 년 동안 진드기 매개 질병이 더 널리 퍼지고 있지만 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학과 유전 및 기능 게놈 도구 4,5 적용과 관련된 문제로 인해 모기와 같은 다른 절지동물 벡터에 뒤쳐져 있습니다.
유전자 편집 기술, 특히 CRISPR / Cas9는 이제 비 모델 유기체에서 기능적 유전체학 연구를 실현 가능하게 만들었습니다. 유기체에서 유전성 돌연변이를 생성하기 위해, 배아 주입은 생식계열 6,7,8,9를 변경하기 위한 구축물을 전달하는 데 선호되는 방법으로 남아 있습니다. 그러나 최근까지4, 진드기 알은 배아10,11을 죽이지 않고 주입하기가 너무 어렵거나 불가능한 것으로 간주되었습니다. 계란의 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력은 진드기에 배아 주입을 방해하는 주요 장애물 중 일부였습니다. 성인, 혈액 공급 I. 견갑골은 3-4 주 (약 100 알 / 일)에 걸쳐 최대 2,000 개의 알12 개로 구성된 단일 클러치를 침착시킵니다. 알은 단독으로 낳고, 각 알은 어머니의 선 Gené의 기관13,14,15의 돌출부 또는 “뿔”에 의해 분비되는 왁스로 코팅됩니다. 이 왁스는 계란을 건조로부터 보호하고 항균 화합물15를 함유하고 있습니다. 진드기 알을 성공적으로 주입하려면 왁스 층을 제거하고 융모막을 부드럽게하고 난자를 건조시켜 타원 내 압력을 낮추어 주입이 난자를 돌이킬 수 없게 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 성공적인 생식계열 형질전환을 위한 배아 주입의 중요성을 이해하고, CRISPR/Cas9 구조를 전달하고 안정적인 생식계열 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있는 I. 견갑골에 대한 프로토콜이 개발되었습니다4. I. scapularis 연구에 대한 기여 외에도이 프로토콜은 다른 진드기 종에도 최적화 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이것은 초기 진드기 배아를 성공적으로 주입하기 위해 개발 된 최초의 프로토콜입니다. ~4%-8%의 생존율이 달성되었으며, 이는 다른 잘 확립된곤충 모델의 배아 주입과 비슷합니다5.
이것이 초기 프로토콜이기 때문에이 프로토콜은 개별 진드기 종에 대해 더욱 정제되고 전문화 될 것으로 예상됩니다. 특히, 주사시기는 종마다 다르며, 배아 발생, 특히 세포화?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Channa Aluvihare와 Yonus Gebermicale, ITF, UMD가 프로토콜 개발의 초기 단계에서 통찰력과 지원을 받았다고 인정합니다. 텅스텐 바늘은 David O’Brochta, ITF, UMD의 관대 한 선물이었습니다. 우리는 I. ricinus 에서이 프로토콜을 테스트하고 통찰력있는 토론을 해주신 Ladislav Simo 박사에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH-NIAID R21AI128393 및 Plymouth Hill Foundation, NY에서 MG-N, 네바다 대학에서 AN까지의 스타트 업 자금, MG-N 및 AN에 대한 국립 과학 재단 보조금 번호 2019609, IGTRCN에서 AS로의 피어 투 피어 보조금.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
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