Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis
Summary
Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.
Abstract
Keneler çeşitli viral, bakteriyel ve protozoan patojenleri iletebilir ve bu nedenle tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörler olarak kabul edilir. Kene kaynaklı hastalıkların artan yüküne rağmen, keneler üzerindeki araştırmalar, fonksiyonel çalışmalar için genetik dönüşüm araçlarının kenelerin benzersiz biyolojisine uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle böcek hastalığı vektörlerinin gerisinde kalmıştır. Genetik müdahaleler sivrisinek kaynaklı hastalıkları azaltmak için dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, bu tür müdahalelerin gelişimi, embriyoların enjekte edilmesiyle stabil germline transformasyonu gerektirir. Böyle bir embriyo enjeksiyon tekniği, keneler de dahil olmak üzere şeliseratlar için eksiktir. Kene embriyoları üzerinde harici kalın balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç gibi çeşitli faktörler, daha önce kenelerde embriyo enjeksiyon protokolü gelişimini engelleyen bazı engellerdir. Mevcut çalışma bu engellerin üstesinden gelmiştir ve siyah bacaklı kene için bir embriyo enjeksiyon tekniği olan Ixodes skapularis burada anlatılmaktadır. Bu teknik, kararlı germ hattı dönüşümleri için CRISPR/Cas9 gibi bileşenler sunmak için kullanılabilir.
Introduction
Keneler, çeşitli viral, bakteriyel, protozoan patojenleri ve nematodları 1,2 iletebilen tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörlerdir. Doğu Amerika Birleşik Devletleri’nde, siyah bacaklı kene, Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (LD) patojeni olan spiroket Borrelia burgdorferi’nin önemli bir vektörüdür. Amerika Birleşik Devletleri’nde her yıl 400.000’den fazla LD vakası bildirilmektedir ve bu da onu ABD’deki en iyi vektör kaynaklı bulaşıcı hastalık haline getirmektedir1. B. burgdorferi’ye ek olarak, dört bakteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi ve Ehrlichia muris eauclarensis), bir protozoan parazit (Babesia microti) ve bir virüs (Powassan virüsü) dahil olmak üzere altı mikroorganizma daha I. skapularisis tarafından bulaşır, bu da bu kene türünü önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirir3 . Kene kaynaklı hastalıklar son yıllarda daha yaygın hale gelirken, keneler üzerine yapılan araştırmalar, kenelerin benzersiz biyolojisi ve genetik ve fonksiyonel genomik araçların uygulanmasıyla ilgili zorluklar nedeniyle sivrisinekler gibi diğer eklembacaklı vektörlerin gerisinde kalmıştır 4,5.
Gen düzenleme teknikleri, özellikle CRISPR / Cas9, artık fonksiyonel genomik çalışmaları model olmayan organizmalarda uygulanabilir hale getirmiştir. Bir organizmada kalıtsal mutasyonlar oluşturmak için, embriyo enjeksiyonu, germ çizgisi 6,7,8,9’u değiştirmek için yapılar sunmak için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar4, kene yumurtalarının embriyoyu öldürmeden enjekte edilmesinin çok zor veya hatta imkansız olduğu düşünülüyordu10,11. Yumurtalar üzerinde kalın bir balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç, kenelerde embriyo enjeksiyonunu engelleyen ana engellerden bazılarıydı. Yetişkin, kanla beslenen I. skapularis, 3-4 hafta boyunca 12 yumurtaya kadar (yaklaşık100 yumurta / gün) 2.000 yumurtadan oluşan tek bir kavrama biriktirir. Yumurtalar tek tek serilir ve her yumurta, glandüler Gené’nin organının çıkıntıları veya “boynuzları” tarafından salgılanan balmumu ile kaplanır13,14,15 annenin. Bu balmumu yumurtaları kurumaya karşı korur ve antimikrobiyal bileşikler içerir15. Kene yumurtalarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için, balmumu tabakasını çıkarmak, koryonu yumuşatmak ve enjeksiyonun yumurtaya geri dönüşümsüz olarak zarar vermemesi için oval içi basıncı azaltmak için yumurtaları kurutmak önemlidir. Başarılı germline transformasyonu için embriyo enjeksiyonlarının kritik önemini anlayarak, bir CRISPR / Cas9 yapısı sunmak ve kararlı germline mutasyonları üretmek için kullanılabilecek I. scapularis için bir protokol geliştirilmiştir4. I. scapularis araştırmasına katkısına ek olarak, bu protokol diğer kene türleri için de optimize edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu, erken kene embriyolarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için geliştirilen ilk protokoldür. Diğer köklü böcek modellerinde embriyo enjeksiyonu ile karşılaştırılabilir olan ~% 4 -% 8’lik bir hayatta kalma oranı elde edilmiştir5.
Bu ilk protokol olduğundan, bu protokolün bireysel kene türlerine göre daha da rafine edileceği ve uzmanlaşacağı tahmin edilmektedir. Özellikle, enjeksiyon zamanlaması, embriyogeneze, özellikle de selülizasy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Channa Aluvihare ve Yonus Gebermicale, ITF, UMD’ye, protokol geliştirmenin ilk aşamasında içgörü ve destek için teşekkür eder. Tungsten iğneleri, David O’Brochta, ITF, UMD’den cömert bir hediyeydi. Bu protokolü I. ricinus’ta test ettiği ve anlayışlı tartışmalar için Dr. Ladislav Simo’ya minnettarız. Bu proje NIH-NIAID R21AI128393 ve Plymouth Hill Vakfı, NY’den MG-N’ye, Nevada Üniversitesi’nden AN’ye başlangıç fonları, MG-N ve AN’ye 2019609 Ulusal Bilim Vakfı Hibe ve IGTRCN’den AS’ye Peer-to-Peer Grant tarafından finanse edildi.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
