Summary
이 프로토콜은 마취 된 설치류에서 방광 내강의 ATP 농도를 측정하는 절차를 설명합니다.
Abstract
방광 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 ATP는 배뇨 조절에 중요한 감각 역할을하는 것으로 생각됩니다. 따라서 생리학적 환경에서 요로상피 ATP 방출을 정확하게 측정하는 것은 방광에서 청도성 신호 전달을 제어하는 메커니즘을 연구하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 기계적으로 유발 된 요로 상피 ATP 방출을 연구하는 기존 기술은 Ussing 챔버에 고정 된 유연한 지지체 또는 방광 조직에 도금 된 배양 세포를 활용합니다. 그러나 이러한 각 기술은 손상되지 않은 방광의 상태를 완전히 모방하지 않습니다. 따라서 설치류 방광의 내강에서 ATP 농도를 직접 측정하기위한 실험 설정이 개발되었습니다.
이 설정에서 마취 된 설치류의 방광은 방광의 돔과 외부 요도 구멍을 통해 카테터를 통해 관류됩니다. 방광의 압력은 요도 카테터를 덮는 동시에 멸균 유체를 돔을 통해 방광으로 관류함으로써 증가합니다. 방광 내 압력 측정은 방광 돔 카테터에 부착 된 압력 변환기를 사용하여 이루어지며, 방광 측정에 사용되는 설정과 유사합니다. 원하는 압력에 도달하면 요도 카테터의 캡을 제거하고 루시페린-루시페라아제 분석에 의해 ATP 정량화를 위해 유체를 수집합니다. 이 실험 설정을 통해 요로 상피 ATP 방출의 기계적 및 화학적 자극을 제어하는 메커니즘은 관류에 다양한 작용제 또는 길항제를 포함하거나 야생형과 유전자 변형 동물 간의 결과를 비교하여 조사 할 수 있습니다.
Introduction
비뇨기 ATP는 배뇨1의 조절에 중요한 감각적 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 예를 들어, ATP는 방광 구 심성 신경의 수용체에 작용하여 흥분성을 증가시켜 충만감을 유발할 수있는 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 것으로 생각됩니다2. 따라서 비뇨기 ATP는 방광 병리의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다고 생각됩니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 과민성 방광(OAB)3, 방광 통증 증후군/간질성 방광염(BPS/IC)4 또는 요로 감염(UTI)5,6을 앓고 있는 환자에서 요중 ATP 농도가 유의하게 증가하며, 모든 상태는 긴급성, 빈도 및 때로는 통증 증가를 특징으로 합니다. 반대로, 방광을 비울 수 없고 때때로 방광 충만감을 감지하는 능력이 감소할 수 있는 저활동성 방광(UAB)을 앓고 있는 환자는 소변 ATP 농도가 감소한 것으로나타났습니다7. 실험적으로 소변 ATP 농도를 조작하면 쥐의 방광 반사가 바뀔 수 있습니다. 방광 내강에서 내인성 ATPase를 차단하여 ATP 농도를 높이면 배뇨 빈도가 증가할 수 있는 반면, 외인성 ATPase를 방광에 주입하여 ATP 농도를 낮추면 배뇨 빈도가 감소합니다8. 따라서 방광 기능에 대한 비뇨기 ATP의 중요성은 분명합니다.
방광 병리학에 대한 비뇨기 ATP의 명백한 중요성을 감안할 때, 요로 상피 ATP 방출의 정확한 측정은 방출을 제어하는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 요로 상피 ATP 방출을 측정하기 위해 다양한 실험 모델을 사용하여 많은 연구가 완료되었습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 1 차 배양 또는 세포주 중 하나 인 세포 배양입니다. 그러나 배양된 요로상피 세포의 사용은 요로상피 세포가 특수 투과성 막(예: Transwell 기술[웰 인서트])에서 성장하지 않는 한 생리학적 분극 형태를 취하지 않는다는 사실로 인해 복잡합니다.9. 따라서, 측정된 임의의 ATP 방출을 생리학과 연관시키는 것은 어렵다. 웰 삽입물에서 성장한 요로 상피 세포는 분극화되어 생체 내에서 볼 수있는 것과 유사한 장벽을 형성 할 수 있습니다. 그러나 완전히 분화 된 요로 상피의 성장에는 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 추가적으로, 웰 인서트를 Ussing 챔버에 장착하고 정점 측에 압력을 가하여 스트레칭을 유발할 수 있지만, 병리학 동안 방광 내부의 조건(즉, 30cmH2O이상의 압력)을 모방하기에 충분한 압력을 가하는 것은 어렵다. 전체 방광 조직은 스트레치 실험을 위해 Ussing 챔버에 장착 할 수도 있지만, 이는 요로 상피 세포 건강 및 요로 상피 장벽 기능을 유지하는 영양 인자와 함께 유기체에서 방광을 제거합니다. 따라서 스트레칭이나 압력에 반응하여 요로 상피에서 ATP의 방출을 연구하는 가장 생리 학적으로 관련된 방법은 생체 내입니다. 실험을 설정하는 데 필요한 수술 기술은 동물 방광 측정술에서 일반적으로 사용되는 것과 동일하므로 해당 기술에 익숙한 사람이라면 누구나 쉽게 수행 할 수 있어야합니다.
이 프로토콜에서는 아래에 설명 된 경 요도 카테터 삽입이 암컷에서 훨씬 쉽기 때문에 체중이 약 200-250g 인 암컷 Sprague Dawley 쥐에서 내강 ATP를 검사하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 그러나, 경요도 카테터 삽입은 또한 수컷 설치류10에서 수행될 수 있다. 경요도 카테터 삽입술이 현재 남녀 모두의 마우스에서도 수행되었기 때문에11, 이러한 실험은 연구팀의 필요에 따라 성별 또는 다양한 크기의 마우스 또는 쥐에 쉽게 적응할 수 있습니다.
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Protocol
설치류에서 수행되는 모든 절차는 해당 지침을 준수해야하며 지역 기관 윤리 검토위원회의 승인을 받아야합니다. 이 원고를 위해 수행 된 실험은 국립 연구위원회의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 피츠버그 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전은 그림 1 을 참조하십시오.
1. 실험실 동물
- 쥐를 사회 주택 (한 케이지에 여러 설치류)에 12 시간의 명암 주기와 물과 음식 알갱이에 대한 자유로운 접근으로 유지하십시오.
2. 마취 및 신경절 차단
- O2 (1 L / min)에서 4 % -5 % 이소 플루 란으로 가스를 주입 한 밀폐 된 상자에 동물을 넣어 초기 마취를 유도하십시오.
- 우레탄을 사용하여 동물을 마취하십시오.
- 우레탄을 1.2g/kg의 용량으로 양측 피하(동물의 각 면에 1/2 용량) 주사합니다. 우레탄이 효과를 발휘할 수 있도록 동물을 새장에 넣으면 일반적으로 2 시간이 걸립니다.
- 또는 우레탄을 복강 내 (i.p.)로 투여하여 전체 용량을 두 개의 개별 용량으로 ~ 10 분 간격으로 주사합니다.
- 우레탄이 효과를 발휘할 때까지 적절한 시간 (sc : 2 시간, i.p. : 30 분)을 기다린 후 집게를 사용하여 동물의 발을 꼬집어 적절한 마취면을 테스트하십시오. 반사가 관찰되면 추가 용량의 우레탄 (0.05-0.1 mL i.p.)을 투여하고 15 분 동안 기다린 다음 다시 테스트하십시오. 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취 평면에 대해 동물을 계속 모니터링하십시오.
- 팽창 중 방광의 수축을 방지하려면 동물에게 헥사 메토 늄 (20 mg / kg, i.p.)과 같은 신경절 차단제를 주사하십시오.
- 실험 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
3. 수술 절차-치골 상 방광 카테터 삽입
- 동물의 복부를 면도하고 정중선 개복술을 시행하여 방광을 노출시킵니다.
- 화염을 사용하여 짧은(~15cm) 길이의 PE50 의료 튜브의 한쪽 끝을 플레어링하여 카테터를 준비합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 22G 바늘을 놓고 Krebs 용액으로 채 웁니다 (구성에 대한 재료 표 참조).
- 방광의 돔 위에 3-0 실크 봉합사의 작은 고리를 놓고 위에서 만든 카테터의 플레어 끝을 삽입 할 수있을만큼 큰 작은 방광 절제술 (가는 가위 또는 18G 바늘 사용)을 수행합니다. 한 손으로 카테터를 제자리에 잡고 다른 손으로 봉합사의 고리를 조여 카테터를 제자리에 고정합니다. 봉합사에 두 개의 매듭을 묶고 플레어 헤드가 방광 벽과 접촉 할 때까지 카테터를 뒤로 당겨 카테터 고정을 마칩니다.
- 또는 방광 측정법12에 대해 이전에 설명한 것처럼 고전적인 지갑 끈 봉합 기술을 사용하여 카테터를 고정합니다.
알림: 이 절차 중에 방광에 기포가 유입되지 않도록 해야 합니다.
- 또는 방광 측정법12에 대해 이전에 설명한 것처럼 고전적인 지갑 끈 봉합 기술을 사용하여 카테터를 고정합니다.
- 카테터를 통해 소량의 Krebs 용액을 주입하여 누출 설정을 테스트합니다. 유체가 방광 절제술에서 누출되면 방광 절제술 주위에 추가 봉합사로 카테터를 다시 고정하십시오.
4. 경요도 카테터 삽입
- 20G x 1" IV 카테터(바늘이 제거된 상태)의 끝을 수술용 윤활유에 담급니다.
- 한 쌍의 집게로 외부 요도 미투스를 부드럽게 잡고 팁이 인접한 질 입구의 벽이 변형 될 때까지 카테터 끝을 꼬리 방향으로 요도 구멍에 삽입합니다. 카테터를 90° 회전하고(카테터의 Luer-Lock 끝을 꼬리 쪽으로 가져옴) 부드럽게 전진합니다. Luer-Lock 허브가 외부 요도 개구부에서 약 5mm 원위가 될 때까지 카테터를 완전히 삽입합니다.
알림: 팁이 방광 내벽을 찌를 수 있으므로 카테터를 너무 멀리 삽입하지 마십시오. 카테터를 전진시키는 동안 저항이 느껴지면 중지했다가 다시 시작하거나 요도에 구멍이 뚫릴 위험이 있습니다. 성공적인 카테터 삽입을 늘리기 위한 팁에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. - 외부 요도 미투스 주위에 짧은 길이의 3-0 실크 봉합사를 고리로 묶어 카테터를 고정하고 카테터 주위의 누출을 방지합니다. 카테터가 실수로 빠지지 않도록 테이프로 꼬리에 고정하십시오.
- 카테터 삽입이 완료되면 치골상 방광 카테터를 통해 Krebs 용액을 방광에 부드럽게 주입하고 체액이 요도 카테터 주변이 아닌 요도 카테터 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 필요한 경우 외부 요도 구멍 주위의 봉합사를 다시 고정하십시오.
- 3-0 실크 봉합사를 사용하여 방광 위의 복부 절개를 닫습니다.
5. 실험 설정
- 요도 카테터를 통한 방광 내 유체의 배출을 도울 수있는 보드에 동물을 고정하십시오. 동물과 보드 사이에 가열 패드와 흡수성 언더 패드를 놓아 체온을 유지하고 요도 카테터에서 배출되는 체액을 흡수합니다.
- 치골 상부 카테터를 3 방향 스톱 콕에 연결하고 카테터를 주사기 펌프 및 압력 변환기에 연결합니다. 압력 변환기를 증폭기와 데이터 수집 시스템을 통해 컴퓨터에 연결합니다.
알림: 주사기 펌프, 변환기 및 방광 카테터를 연결하는 튜브에 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다. - 압력 변환기 및/또는 데이터 수집 소프트웨어 제조업체에서 제안한 절차를 사용하여 방광 압력 기록을 교정합니다.
- 0.1mL/min의 속도로 치골상 카테터를 통해 Krebs 용액을 주입하고 유체가 요도 카테터에서 1시간 동안 배출되도록 하여 카테터 이식 중에 방출되는 잔류 ATP를 씻어냅니다.
- 이 세척 기간이 지나면 Luer-Lock 플러그를 사용하여 요도 카테터를 덮고 방광의 압력을 측정합니다. 방광 수축을 나타내는 압력의 급격한 증가없이 30cm H 2 O의 압력으로 방광 내압력이 천천히 상승하는 것을 찾으십시오 (그림 2 참조). 방광 손상을 방지하기 위해 압력이 30cm H2O에 도달하면 요도 카테터에서 플러그를 제거하십시오.
알림: 1 시간 후에도 방광 수축이 계속 발생하면 헥사 메 토늄을 추가로 투여하십시오 (5mg / kg 용량 i.p.).
6. 샘플 수집
- 방광에 0.1mL/min을 주입하고 요도 카테터에서 용출액을 수집합니다. ATP에 대해 용리액의 100μL 분취량을 즉시 테스트하거나(아래 참조) 이후 배치 정량화를 위해 동결합니다.
- 방광 팽창이 내강 ATP 농도에 미치는 영향을 테스트하려면 요도 카테터를 플러그로 덮고 원하는 수준에 도달할 때까지 방광 압력을 모니터링합니다. 이어서, 요도 카테터의 캡을 풀고 전술한 바와 같이 ATP 측정 또는 동결을 위한 용출액을 수집한다.
- 각 팽창 후 방광을 쉬게하고 추가 샘플을 채취하기 전에 10-15 분 동안 씻어냅니다. 반복성을 입증하기 위해 각 원하는 팽창 압력에서 총 3-5개의 팽창 샘플과 3-5개의 샘플을 취하십시오.
- ATP 방출에 대한 약물의 효과를 테스트하려면 방광을 주입하는 Krebs 용액을 선택한 약물이 들어있는 Krebs로 전환하십시오. 약물이 효과를 내기 위해 0.1mL/min으로 10-15분 동안 관류한 다음 6.1단계 및 6.2단계에 설명된 대로 팽창되지 않고 팽창된 방광에서 샘플을 수집합니다.
7. 수집된 샘플에서 ATP 정량화
- 제조업체의 지침과 루미노미터에 따라 시중에서 판매하는 루시페린/루시페라아제 분석 키트를 사용하여 수집된 100μL 샘플에서 ATP를 정량화합니다.
- ATP를 정량화하려면 100μL 향수 샘플을 50μL의 분석 혼합물과 결합하고 판독을 위해 루미노미터에 놓습니다. 광도계에서 보고한 상대광 단위(RLU)를 ATP 농도로 변환하려면 1μM에서 10pM 범위의 Krebs 용액에서 ATP를 10배 희석하여 표준 곡선을 만들고 광도계에서 읽습니다. 결과 판독값을 그래프에 플로팅하고 비선형(2차) 회귀를 수행하여 동물에서 채취한 샘플의 농도를 외삽합니다.
참고: 많은 약물이 루시페린/루시페라아제 반응을 방해하므로 실험에서 테스트한 모든 약물 용액에 대해 ATP 표준을 만드는 것이 중요합니다.
- ATP를 정량화하려면 100μL 향수 샘플을 50μL의 분석 혼합물과 결합하고 판독을 위해 루미노미터에 놓습니다. 광도계에서 보고한 상대광 단위(RLU)를 ATP 농도로 변환하려면 1μM에서 10pM 범위의 Krebs 용액에서 ATP를 10배 희석하여 표준 곡선을 만들고 광도계에서 읽습니다. 결과 판독값을 그래프에 플로팅하고 비선형(2차) 회귀를 수행하여 동물에서 채취한 샘플의 농도를 외삽합니다.
8. 동물의 안락사
- 실험이 완료되고 모든 샘플이 수집되면 USDA 지침 및 국립 연구위원회의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
- 실험 설정에서 마취된 동물을 제거하고 밀폐된 상자에 넣고 100%CO2로 가스를 가스화합니다. 충전 속도가 분당 챔버 부피의 30%-70%와 같은지 확인합니다(예: 부피가 3L인 상자의 경우 7-10L/분). 호흡이 멈춘 후 적어도 1분 동안CO2 흐름을 계속한다.
- 죽음을 보장하기 위해 2 차 형태의 안락사를 사용하십시오.
- 흉골의 꼬리 끝에있는 피부의 작은 플랩을 잡고 날카로운 가위로 횡격막의 피부와 근육계에 작은 구멍을 뚫어 안락사의 2 차 형태로 개흉술을 시행하십시오. 가위를 개구부에 삽입하고 흉곽을 통해 주둥이를 자르고 흉강을 노출시켜 개흉술을 완료하십시오.
참고: 안락사된 동물은 제도적 지침에 따라 폐기해야 합니다.
- 흉골의 꼬리 끝에있는 피부의 작은 플랩을 잡고 날카로운 가위로 횡격막의 피부와 근육계에 작은 구멍을 뚫어 안락사의 2 차 형태로 개흉술을 시행하십시오. 가위를 개구부에 삽입하고 흉곽을 통해 주둥이를 자르고 흉강을 노출시켜 개흉술을 완료하십시오.
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Representative Results
설명 된 프로토콜은 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전을 사용하여 방광 내강에서 생체 내에서 urothelial ATP 방출을 정확하게 측정 할 수 있습니다 ( 그림 1 참조). 이를 통해 연구원은 생리학적 환경에서 스트레치 매개 ATP 방출에 대한 약물의 효과를 조사할 수 있습니다.
그림 1: 실험 설정 . (A) 다양한 장비에 레이블이 지정된 실험 설정을 보여주는 이미지. 빨간색 직사각형으로 윤곽선이 그려진 동물의 영역은 B로 표시됩니다 . (B) 수술 후 쥐의 복부를 묘사 한 사진. 방광 돔에 삽입되고 연결된 치골 상 카테터와 외부 구멍을 통해 삽입 된 요도 카테터에 유의하십시오. 요도 카테터는 방광 카테터를 통해 관류하는 동안 방광 압력이 증가한다는 것을 보여주기 위해 사진에 연결되어 있습니다. 실험 중에 복부 개구부는 봉합되어 닫히지 만 방광의 시각화를 허용하기 위해 여기에 열린 상태로 두었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
설치류 방광에서 스트레치 매개 ATP 방출의 성공적인 측정을 위해 가장 중요한 것은 배뇨 반사가 차단되어 방광이 일반적으로 배뇨 반사를 활성화하기에 충분한 임계 압력 이상으로 팽창되도록하는 것입니다. 그림 2A에 표시된 것처럼 요도 카테터가 막히면 방광에 용액을 주입하면 방광이 수축함에 따라 방광 내 압력이 급격히 상승합니다. 우리는 수축이 아닌 수동 스트레칭이 요로 상피 ATP 방출에 미치는 영향에 관심이 있기 때문에 동물은 신경절 차단제 인 헥사 메 토늄으로 치료되어 배뇨 반사를 예방합니다. 도 2B에서 알 수 있듯이, 헥사 메 토늄이 투여 될 때, 요도 카테터가 차단 된 상태에서 방광에 용액을 주입하면 방광 내 압력이 훨씬 더 점진적으로 상승하여 수축없이 압력이 30cm H2O까지 상승 할 수 있습니다. 이를 통해 과민성 방광, 부분 방광 출구 폐쇄 또는 척수 손상 후 배뇨근-괄약근 이형성증에서 관찰되는 것과 같이 병리학과 관련이있을 정도로 충분히 높은 압력에서 내강 ATP 방출을 측정 할 수 있습니다. 배뇨 반사를 완전히 차단하기 위해 헥사메토늄을 보충해야 할 수도 있지만 과다 복용을 초래할 만큼 충분히 투여하지 않도록 주의해야 합니다. 이로 인해 심 박출량이 크게 감소하고 실험의 품질이 저하 될 수 있습니다. 방광 반사에 대한 동일한 억제 효과는 골반 신경을 양측으로 절단하거나 L4 수준 이상에서 척수를 절단함으로써 얻을 수 있습니다. 물론 이것은 실험 설정의 어려움과 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 크게 증가시킵니다.
그림 2 : 쥐의 압력 기록. (A) 전과 후 (B) 신경절 차단. 화살표는 요도 카테터가 막혔을 때를 나타냅니다. 상단 트레이스의 압력은 압력이 임계값에 도달하면 빠르게 증가하여 미투리션을 유도하는 반면 하단 트레이스의 압력은 점차 상승합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 실험에 대한 또 다른 매우 중요한 고려 사항은 표준 곡선을 사용하여 광도계 판독값(일반적으로 RLU로 표시됨)을 ATP 농도로 적절하게 변환하는 것입니다. 루시페린/루시페라아제 반응은 간섭제(13)에 매우 민감하다. 이 간섭은 루시페린/루시페라아제와의 직접적인 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 다수의 화합물은 루시페라아제의 경쟁적 또는 비경쟁적 억제제로서 작용할 수 있고; 한 연구에 따르면 분자 라이브러리 소분자 저장소에 있는 화합물의 ~3%가 11μM 미만의 농도에서 반딧불이 루시페라아제를 억제할 수 있다고 제안했습니다14. 더욱이, 루시페린은 산화제에 민감하여, 발광-생성 반응(15)에 이용가능한 기질의 양을 감소시킨다. 반응의 보조 인자인 마그네슘의 가용성을 변경하여 루시페린/루시페라아제 반응을 방해하는 것도 가능합니다. 예를 들어, 시험관내 ATP 실험에서 기계적 스트레치를 모방하는 하나의 일반적인 기술은 관류 용액의 삼투압을 감소시켜 세포 팽창을 유도하는 것입니다. 그러나 많은 연구자들은 용액을 물로 희석하여 루시페린/루시페라아제 반응에서 보조 인자로 작용할 수 있는 마그네슘의 농도를 줄임으로써 이러한 감소를 달성합니다. 또한 일부 약물은 마그네슘 염으로 판매되어 용액 내 마그네슘의 양을 크게 증가시켜 발광 판독 값의 측정 가능한 차이를 유발할 수 있습니다. 마지막으로, 약물 용액이 루시페린/루시퍼라아제 반응에 의해 생성된 빛을 정확하게 측정하는 능력을 방해할 수 있습니다. 브릴리언트 블루 FCF (BB-FCF, ERIOGLAUCINE 또는 FD&C Blue 염료 #1로도 알려짐)는 판넥신 매개 ATP 방출16의 특이적 억제제이다. 유효 선량에서 브릴리언트 블루 FCF 용액은 약 600nm17의 피크에서 빛을 흡수하는 뚜렷한 청색 색조를 갖습니다. 이것은 반딧불이 루시페라아제에 의해 방출되는 빛의 파장 범위 내에 있습니다. 따라서 BB-FCF 실험에서 발광이 크게 감소합니다. 따라서 각 실험 약물을 포함하는 용액에 용해 된 알려진 양의 ATP를 사용하는 표준 곡선을 사용하여 실험 중 ATP 방출을 정량화해야합니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 BB-FCF (100μM)는 표준 곡선의 기울기를 크게 감소 시키며, 이는 샘플의 ATP 농도에 대해 계산 된 값을 크게 변경하기에 충분합니다. 그림 3의 하단에서 볼 수 있듯이 Krebs 표준을 사용하여 BB-FCF를 포함하는 샘플에서 ATP 농도를 계산하면 ATP 농도가 ~ 50 % 과소 평가 될 수 있습니다. 어떤 경우에는 잘못된 표준 곡선을 사용하면 ATP 방출에서 약물 매개 변화가 가려 지거나 변화가 발생한 것처럼 잘못 나타날 수 있습니다. 예를 들어, 그림 3에 묘사 된 실험에서 모든 샘플에 대해 Krebs 표준을 사용하면 Brilliant Blue FCF가 실제로 ~ 42 % (16.6에서 9.6 nM) 만 감소했을 때 ATP 방출을 ~ 67 % (16.6에서 5.5 nM) 감소시킨 것으로 보입니다.
그림 3: ATP 표준 곡선에 대한 실험 약물의 효과. 판넥신 채널 길항제인 브릴리언트 블루는 주어진 ATP 농도에 대해 측정된 RLU를 크게 변경하며, 이는 보정되지 않은 경우 측정된 ATP를 과소평가하는 결과를 초래할 수 있습니다. 약어: RLU = 상대 조명 단위; BB-FCF = 브릴리언트 블루 FCF. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
명심해야 할 또 다른 고려 사항은 ATP가 일반적으로 손상의 결과로 조직에서 방출되며 이러한 수술 절차와 요도 카테터 삽입은 설정 후 너무 빨리 복용하면 비정상적으로 높은 ATP 판독값을 초래한다는 것입니다. 이 절차에서는 실험을 설정한 후 1시간의 세척 기간을 설명하며 건너뛰어서는 안 됩니다. 우리는 1 시간 후에 방광이 팽창되지 않을 때 채취 한 샘플에서 측정 된 ATP 농도가 상대적으로 낮은 반면 (~ 10-30 nM) 세척 기간 전에 채취 한 샘플은 훨씬 더 높을 수 있음을 발견했습니다. ATP 수치가 짧은 기간 동안 상승된 상태를 유지할 수 있으므로 팽창 사이에 5분의 짧은 세척도 수행해야 합니다. 좋은 경험 법칙은 실험 시작과 각 팽창 후에 여러 샘플에서 ATP를 측정하고 ATP 판독 값이 평준화 될 때만 진행하는 것입니다. 그림 4에서는 다양한 시점에서 측정한 일반적인 실험의 표현을 보여줍니다. 세척 전 취한 높은 판독값(샘플 #1 및 #5)과 세척 후 측정한 판독값(샘플 #2 및 #6)에 유의하십시오.
그림 4: 일반적인 실험의 표현. 일반적인 압력 기록의 양식화된 표현입니다. 각 숫자는 샘플을 채취하고 ATP를 측정한 시점을 나타냅니다: 1) 셋업 완료 직후, 세척 기간 전, 2) 1시간 세척 기간 후, 3) 팽창 직전, 4) 팽창 중, 5) 팽창 직후, 6) 팽창 후 짧은 세척 기간 후. 삽입 표는 각 샘플에 대한 대표적인 RLU 값과 ATP 농도를 보여줍니다. 약어: RLU = 상대 조명 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 는 요로상피로부터 ATP 방출의 기작을 조사한 실험 결과의 대표적인 그래프를 나타낸 것이다. 그림 5A에 도시된 바와 같이, 압력이 증가하면 방광 내강에서 ATP 농도가 크게 증가하며, 30cm의 물의 압력은 팽창되지 않은 대조군의 거의 2.5배 농도를 증가시킵니다. ATP의 가수 분해를 촉매하는 효소 인 2U / mL의 아피라아제의 방광 내 관류는 방광 내강에서 측정 된 ATP 농도를 크게 감소시킵니다. 반대로, 요로 상피에 존재하는 NTPDases의 억제제 인 ARL67156의 방광 내 관류는 내강 ATP 농도를 상당히 증가시킵니다. 도 5B 는 요로상피로부터 ATP 방출을 유도하는 스트레치 기작으로의 실험을 도시한 것이다. 판넥신 채널 길항제 브릴리언트 블루 FCF (BB-FCF, 100 μM) 또는 카르베녹솔론 (CBX, 100 μM)과의 관류는 모든 압력에서 방광 내강으로의 ATP 방출을 상당히 감소시킵니다. 내강 ATP 농도는 코넥신 차단제 18α-글리시레틴산이 관류될 때 감소하지 않으며, 이는 팽창 유발 ATP 방출이 코넥신 채널이 아닌 판네신 채널에 의해 매개됨을 나타냅니다.
그림 5: 방광 내강에서 팽만감 유발 ATP 방출의 대표적인 측정. (A) 방광의 팽창은 내강 ATP 농도를 증가시키며, 이는 NTPDase 아피라아제(2U/mL)의 존재 하에서 감소하거나 내인성 NTPDasesare가 ARL67156(10μM)으로 억제될 때 증가할 수 있습니다. (B) 팽창-유발 ATP 방출은 판넥신 채널 길항제 브릴리언트 블루 FCF (BB-FCF, 100 μM) 및 카르베녹솔론 (CBX, 100 μM)에 의해 차단되지만, 코넥신 채널 길항제 18α-글리시르레틴산 (18α-GA, 50 μM)은 차단되지 않는다. 데이터는 표준 오차 막대가 있는 평균으로 표시됩니다. ** p< 선으로 표시된 두 막대 사이에 0.05, ## p< 동일한 팽창에서 Krebs 대조군과 비교하여 0.05입니다. 이 그림은 Beckel et al.8의 허가를 받아 재 인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
요로 상피 ATP 방출에 대한 대부분의 연구는 불멸화 된 세포주 또는 설치류 요로 상피 세포의 1 차 배양을 사용하여 배양 된 세포에서 수행됩니다. 이러한 모델은 상대적으로 높은 처리량(즉, 하나의 배양/계대가 많은 세포 플레이트/접시를 만들 수 있음)이라는 이점이 있지만, 1) 특수 지지체에서 성장하지 않는 한 요로 상피 세포가 분극적으로 성장할 수 없고 2) 배양된 세포를 생리학적 수준의 스트레치/압력에 노출시키는 데 어려움이 있기 때문에 생리학적 관련성이 감소합니다. 이러한 한계를 처리하는 한 가지 방법은 설치류에서 방광을 제거하고 잘라서 Ussing 챔버에 넣고 생리적 용액으로 채워진 두 개의 절반 챔버 사이에 방광 조직을 삽입하는 것입니다. 이를 통해 연구원은 원래 분극 상태의 요로 상피를 챔버의 요로 상피 측에 부피를 추가하여 팽창시켜 챔버의 방광 조직이 늘어나도록 할 수 있습니다. 그러나 이 스트레칭을 생체 내에서 요로상피에서 볼 수 있는 팽창과 연관시키는 것은 어렵습니다. 더욱이, Ussing 챔버 내의 팽창 유발 ATP는 챔버에 포함 된 많은 양의 생리 학적 유체로 방출되어 ATP의 농도를 수 배로 희석시킵니다. 이 절차를 사용하여 방광 압력을 직접 측정하여 팽창을 생리학 또는 병태생리학과 관련된 범위로 유지할 수 있습니다. 또한, 우리는 ATP 농도를 체외 조직을 유지하는 데 사용되는 임의적이고 과도한 양의 유체가 아닌 내강 유체에서 직접 측정하기 때문에 측정 된 농도를 수정할 필요가 없습니다. 따라서이 논문에 설명 된 절차를 통해 연구원은 방광의 생리적 또는 병리 생리 학적 조건과 훨씬 더 유사한 조건에서 방광 내강에서 ATP 방출을 검사 할 수 있습니다.
설명 된 기술은 반사 방광 활동에 대한 약물의 효과를 연구하는 데 사용되는 표준 방광 측정 기술과 매우 유사하며 이러한 실험을 일상적으로 수행하는 사람이라면 누구나 쉽게 수행해야합니다. 그러나 방광 카테터 삽입을 처음 접하는 연구자에게는 알아야 할 몇 가지주의 사항이 있습니다. 첫째, 경요도 카테터 삽입은 설치류 요도의 곡률로 인해 경험이 없는 사람들에게는 어려울 수 있습니다. 이것은 또한 우레탄 마취 하에서도 외부 요도 괄약근의 압박감으로 인해 더 어려워 질 수 있습니다. 연구원은 카테터를 요도로 강제로 넣으려고하지 않아야하는데, 이는 염증과 부종을 증가시켜 요도를 성공적으로 카테터 삽입하기가 더 어려워 질 가능성이 높기 때문입니다. 또한 요도 벽을 통해 카테터를 찌르면 전체 실험을 망칠 수 있습니다.
우리는 성공률을 높이기위한 몇 가지 팁과 요령을 개발했습니다. 예를 들어, 요도 괄약근을 이완시키기 위해 동물에게 또 다른 짧은 용량의 흡입 이소 플루 란 (0.5 % -1.0 %)을 투여해야하는 경우가 있습니다. 이것은 우레탄과 이소 플루 란의 조합이 호흡 억제를 유발할 수 있으므로 드물게 조심스럽게 수행해야합니다. 또 다른 트릭은 카테터 끝을 외부 요도 구멍에 삽입하기 전에 2 % 리도카인 용액에 담그는 것입니다. 이것은 종종 몇 분 후에 괄약근이 이완되도록 합니다. 동물의 복부를 부드럽게 눌러 방광을 비우는 것도 요도 괄약근을 이완시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로 더 작은 게이지 카테터를 사용해야 할 수도 있습니다. 우리는 때때로 특히 작은 동물의 경우 24G 카테터를 사용합니다. 그러나 더 작은 게이지 경요도 카테터를 사용할 때 요도 카테터의 느린 배액과 일치하도록 방광으로의 주입 속도를 줄여야 할 수도 있음을 명심하십시오. 그렇게 하지 않으면 요도 카테터가 캡핑되지 않았음에도 불구하고 방광압이 상승할 수 있습니다.
우레탄은이 프로토콜에서 마취제로 사용된다는 점에 유의해야합니다. 우레탄은 하부 요로를 연구하는 실험실에서 일반적으로 사용되는데, 다른 마취제는 그렇지 않은 반면 배뇨 반사를 절약하기 때문입니다. 이 때문에, 우레탄 마취하에 ~ 7-10 cm H2O의 압력 이상의 방광의 팽창은 배합 반사를 유발할 것이다. 우리는 수동 팽창에 대한 반응으로 ATP 방출에 관심이 있기 때문에이 프로토콜은 신경절 차단제 헥사 메토 늄을 사용하여 방광 수축을 차단해야합니다. 이것은 출구 폐쇄를 수반하는 방광 병리학에서 흔히 볼 수 있는 더 높은 방광내 압력(즉, 30 cmH2O)에 반응하여 ATP 방출의 측정을 가능하게 한다. 따라서 우레탄 / 헥사 메 토늄을 사용하면 장기간 팽창 유발 내강 ATP 방출을 측정 할 수 있습니다 (두 약물의 작용 지속 시간은 시간 단위로 측정됩니다). 그러나 일부 실험실에서는 케타민과 같은 배혈 반사를 아끼지 않는 마취제를 사용하고 신경절 차단제의 필요성을 제거하는 것을 선호할 수 있습니다. 이것은 마취제의 작용 지속 시간이 짧기 때문에 더 자주 (또는 연속적인) 투여가 필요하지만이 절차에서도 잘 작동합니다.
ATP를 측정하는이 기술과 비뇨기과 연구자에게 익숙한 일반적인 방광 측정 설정 사이의 주목할만한 차이점 중 하나는 표준 등장 성 식염수 대신 완충 된 Krebs 용액을 관류로 사용한다는 것입니다. ATP는 다소 불안정한 분자이며 완충 용액에서 다소 안정화됩니다. 또한 Krebs 용액의 조성은 식염수보다 소변의 조성에 훨씬 가깝기 때문에 이러한 실험에 임상 적 관련성이 추가됩니다. 요로 상피 ATP 방출의 제어는 칼슘 투과성 채널에 의해 조절되는 것으로 나타 났으며 정상 식염수에서 칼슘이 부족하면 ATP 방출에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 이것은 중요한 고려 사항입니다. 용액에서 ATP의 불안정성은 루시페린-루시페라아제 반응을 사용하여 샘플을 즉시 정량화할 것을 제안하는 이유이기도 합니다. 그러나 연구자가 샘플을 즉시 읽을 수없는 경우 ATP의 분해를 제한하기 위해 샘플을 가능한 한 빨리 냉동해야합니다.
이 기술의 한 가지 한계는 내강 ATP 방출만 측정하고 요로상피의 장막측에서 ATP 방출을 측정할 수 없다는 것입니다. ATP는 구 심성 흥분성에 직접적인 영향을 미치기 위해 장막 측에서 방출되는 것으로 믿어집니다. 그러나이 릴리스를 직접 측정하는 것은 어렵습니다. 이 경우, Transwell 플레이트와 같은 투과성 막 지지체에서 성장한 세포를 사용하거나 Ussing 챔버 실험을 위해 요로상피를 외과적으로 제거하는 것이 바람직한 기술입니다. 그러나, 방광 병리학에서 내강 ATP의 명백한 중요성을 감안할 때,이 실험 모델은 병리학 동안 urothelial ATP 방출을 제어하는 세포 메커니즘을 밝히는 데 유용한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK)에서 JMB (DK117884)로의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
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