Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.
Abstract
Mikroglia sind die ansässigen Immunzellen myeloischen Ursprungs, die die Homöostase in der Mikroumgebung des Gehirns aufrechterhalten und zu einem Schlüsselakteur bei mehreren neurologischen Erkrankungen geworden sind. Die Untersuchung menschlicher Mikroglia in Gesundheit und Krankheit stellt aufgrund der extrem begrenzten Versorgung mit menschlichen Zellen eine Herausforderung dar. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die von menschlichen Individuen stammen, können verwendet werden, um diese Barriere zu umgehen. Hier wird gezeigt, wie menschliche iPS-Zellen in Mikroglia-ähnliche Zellen (iMGs) für In-vitro-Experimente differenziert werden können. Diese iMGs zeigen die erwarteten und physiologischen Eigenschaften von Mikroglia, einschließlich Mikroglia-ähnlicher Morphologie, Expression geeigneter Marker und aktiver Phagozytose. Zusätzlich wird eine Dokumentation zur Isolierung und Markierung von Synaptosomensubstraten bereitgestellt, die von humanen iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen (i3LMNs) stammen. Ein Lebendzell-Longitudinal-Imaging-Assay wird verwendet, um das Verschlingen menschlicher Synaptosomen zu überwachen, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff markiert sind, was Untersuchungen der phagozytischen Kapazität von iMG ermöglicht. Die hierin beschriebenen Protokolle sind allgemein auf verschiedene Bereiche anwendbar, die die Biologie der menschlichen Mikroglia und den Beitrag von Mikroglia zur Krankheit untersuchen.
Introduction
Mikroglia sind die residenten Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Mikroglia sind auch im erwachsenen Gehirn wichtig, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und aktiv auf Traumata und Krankheitsprozesse zu reagieren. Kumulative Evidenz zeigt, dass Mikroglia einen Schlüsselbeitrag zur Pathogenese multipler neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen leisten 1,2. Obwohl das aktuelle Wissen über die Mikrogliabiologie überwiegend aus Mausmodellen abgeleitet wurde, haben neuere Studien wichtige Unterschiede zwischen murinen und menschlichen Mikroglia aufgeklärt, was die Notwendigkeit der Entwicklung von Technologien zur Untersuchung der Genetik und der biologischen Funktionen menschlicher Mikroglia unterstreicht 3,4. Die Isolierung von Mikroglia aus seziertem Primärgewebe kann die Eigenschaften der Mikroglia stark verändern5, was möglicherweise die mit solchen Zellen erzielten Ergebnisse verwirrt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane iPS-Zellen in iMGs zu differenzieren und dadurch ein Zellkultursystem zur Untersuchung menschlicher Mikroglia unter basalen Bedingungen bereitzustellen. Darüber hinaus ist hierin ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines vollständig menschlichen Modellsystems enthalten, um die Funktionalität von iMGs sowohl als Qualitätskontrollmaßnahme als auch zur Beurteilung der iMG-Dysfunktion im Kontext der Krankheit zu untersuchen.
Mehrere Protokolle zur Mikroglia-Differenzierung von iPS-Zellen sind kürzlich in der Literatur 6,7,8,9,10 aufgetaucht. Mögliche Nachteile einiger Protokolle sind verlängerte oder lange Differenzierungsperioden, die Zugabe mehrerer Wachstumsfaktoren und/oder komplexe experimentelle Verfahren 6,9,10. Hier wird eine “benutzerfreundliche” Differenzierungsmethode demonstriert, die Aspekte der Mikroglia-Ontogenese durch Differenzierung von iPS-Zellen in Vorläuferzellen, die als primitive Makrophagen-Vorläufer (PMPs) bezeichnet werden, rekapituliert7,11. PMPs werden wie zuvor beschrieben generiert, wobei einige Optimierungen hierin12 vorgestellt werden. Die PMPs ahmen MYB-unabhängige Dottersack-abgeleitete Makrophagen nach, die während der Embryonalentwicklung Mikroglia erzeugen, indem sie vor dem Schließen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen13. Um PMPs in iMGs zu differenzieren, verwendeten wir eine schnelle und vereinfachte Monokulturmethode, die auf Protokollen von Haenseler et al. und Brownjohn et al. basiert, mit einigen Modifikationen, um eine effiziente Mikroglia-Differenzierungsmethode zu erzeugen, in der iMGs Mikroglia-angereicherte Marker robust exprimieren 7,8. Diese Differenzierungsmethode kann in Laboratorien mit Expertise in der Kultur von iPSCs und mit Forschungszielen reproduziert werden, die darauf abzielen, die Mikrogliabiologie anhand eines humanen Modellsystems zu untersuchen.
iPSC-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung mikroglialer kanonischer Funktionen, einschließlich Phagozytose. Mikroglia sind die professionellen Phagozyten des Gehirns und des ZNS, wo sie Zelltrümmer, aggregierte Proteine und abgebautes Myelin14 entfernen. Mikroglia funktionieren auch beim synaptischen Umbau durch Verschlingen von Synapsen und bei der Abwehr äußerer Infektionen durch Phagozytose von Krankheitserregern15,16. In diesem Protokoll wird die Phagozytose durch iMGs unter Verwendung menschlicher Synaptosomen als Material für das iMG-Engulfment bewertet. Zu diesem Zweck wird eine Beschreibung zur Isolierung von Synaptosomen beschrieben, die von humaneni3LMNs abgeleitet sind. Die i3-LMN-abgeleiteten menschlichen Synaptosomen sind mit einem pH-sensitiven Farbstoff markiert, der die Quantifizierung von Synaptosomen ermöglicht, die während der Phagosomenverarbeitung und des Abbaus in vitro in sauren Kompartimenten lokalisiert sind. Ein Phagozytose-Assay mit Lebendzellmikroskopie wird gezeigt, um den dynamischen Prozess der Mikroglia-Verschlängung in Echtzeit zu überwachen. Dieser funktionelle Assay schafft eine Grundlage, um mögliche Defekte der Mikroglia-Phagozytose in Gesundheit und Krankheit mit einem vollständigen menschlichen System zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Methode, um iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen in ~6-8 Wochen mit hoher Reinheit und in ausreichender Ausbeute zu erhalten, um Immunfluoreszenzexperimente und andere Assays durchzuführen, die eine höhere Anzahl von Zellen erfordern. Dieses Protokoll hat bis zu 1 × 106 iMGs in 1 Woche ergeben, was eine Protein- und RNA-Extraktion und entsprechende Downstream-Analysen (z.B. RNASeq, qRT-PCR, Western Blot, Massenspektrometrie) ermö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Michael Ward für die Bereitstellung der WTC11 hNIL iPSC-Linie für die Motoneuronendifferenzierung und den Jackson Laboratories für die Lieferung der KOLF2.1J WT-Klon-B03-iPSC-Linie für die Mikroglia-Differenzierung. Wir danken auch Dorothy Schafer für ihre Unterstützung bei der Implementierung der Protokolle, Anthony Giampetruzzi und John Landers für ihre Hilfe beim Lebendzellbildgebungssystem sowie Hayden Gadd für seine technischen Beiträge während der Überarbeitung und Jonathan Jung für seine Mitarbeit an dieser Studie. Diese Arbeit wurde vom Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience der UMASS Chan Medical School und dem Angel Fund, Inc. unterstützt.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
