Человеческие микроглиоподобные клетки: дифференциация из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и анализ фагоцитоза живых клеток in vitro с использованием синаптосом человека
Summary
Этот протокол описывает процесс дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в микроглиоподобные клетки для экспериментов in vitro . Мы также включили подробную процедуру генерации синаптосом человека из нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC, которые могут быть использованы в качестве субстрата для анализов фагоцитоза in vitro с использованием систем визуализации живых клеток.
Abstract
Микроглии являются резидентными иммунными клетками миелоидного происхождения, которые поддерживают гомеостаз в микроокружении мозга и стали ключевым игроком в многочисленных неврологических заболеваниях. Изучение микроглии человека в здоровье и болезнях представляет собой проблему из-за крайне ограниченного запаса человеческих клеток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs), полученные от людей, могут быть использованы для обхода этого барьера. Здесь показано, как дифференцировать человеческие ИПСК в микроглиоподобные клетки (iMG) для экспериментов in vitro . Эти iMG демонстрируют ожидаемые и физиологические свойства микроглии, включая микроглиоподобную морфологию, экспрессию надлежащих маркеров и активный фагоцитоз. Кроме того, предоставляется документация по выделению и маркировке субстратов синаптосом, полученных из нижних двигательных нейронов человека, полученных из iPSC (i3LMN). Продольный анализ визуализации живых клеток используется для мониторинга поглощения синаптосом человека, помеченных pH-чувствительным красителем, что позволяет исследовать фагоцитарную способность iMG. Протоколы, описанные в настоящем документе, широко применимы к различным областям, которые исследуют биологию микроглии человека и вклад микроглии в заболевание.
Introduction
Микроглии являются резидентными иммунными клетками в центральной нервной системе (ЦНС) и играют решающую роль в развитии ЦНС. Микроглия также важна в мозге взрослого человека для поддержания гомеостаза и активного реагирования на травмы и болезненные процессы. Кумулятивные данные показывают, что микроглия является ключевым фактором патогенеза множественных заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний 1,2. Хотя современные знания о биологии микроглии были в основном получены из мышиных моделей, недавние исследования выявили важные различия между мышиной и человеческой микроглией, подчеркнув необходимость разработки технологий для изучения генетики и биологических функций микроглии человека 3,4. Выделение микроглии из рассеченной первичной ткани может сильно модифицировать свойства микроглии5, потенциально смешивая результаты, полученные с такими клетками. Общей целью этого метода является дифференциация человеческих ИПСК в иМГ, тем самым обеспечивая систему клеточных культур для изучения микроглии человека в базальных условиях. Кроме того, анализ фагоцитоза с использованием полностью человеческой модельной системы включен в настоящий документ в качестве средства для изучения функциональности iMG, как в качестве меры контроля качества, так и для оценки дисфункции iMG в контексте заболевания.
Множественные протоколы дифференциации микроглии от ИПСК недавно появились в литературе 6,7,8,9,10. Потенциальные недостатки некоторых протоколов включают длительные или длительные периоды дифференциации, добавление нескольких факторов роста и/или сложные экспериментальные процедуры 6,9,10. Здесь продемонстрирован «удобный для пользователя» метод дифференцировки, который повторяет аспекты онтогенеза микроглии путем дифференцировки иПСК в клетки-предшественники, называемые примитивными предшественниками макрофагов (PMP)7,11. PMP генерируются, как описано ранее, с некоторыми оптимизациями, представленными здесь12. PMP имитируют MYB-независимые макрофаги, полученные из желточного мешка, которые порождают микроглию во время эмбрионального развития, вторгаясь в мозг до закрытия гематоэнцефалического барьера13. Чтобы окончательно дифференцировать PMP в iMG, мы использовали быстрый и упрощенный метод монокультуры, основанный на протоколах Haenseler et al. и Brownjohn et al., с некоторыми модификациями для создания эффективного метода дифференциации микроглии, в котором iMG надежно экспрессируют маркеры, обогащенные микроглией 7,8. Этот метод дифференциации может быть воспроизведен в лабораториях, обладающих опытом в культуре иПСК и с исследовательскими целями, направленными на изучение биологии микроглии с использованием системы моделей человека.
Микроглии, полученные из iPSC, представляют собой биологически значимый источник микроглии человека для экспериментов in vitro и являются важным инструментом для исследования канонических функций микроглии, включая фагоцитоз. Микроглии являются профессиональными фагоцитами мозга и ЦНС, где они очищают клеточный мусор, агрегированные белки и деградированный миелин14. Микроглия также функционирует в синаптическом ремоделировании путем поглощения синапсов и в защите от внешних инфекций через фагоцитоз патогенов15,16. В этом протоколе фагоцитоз iMGs оценивается с использованием синаптосом человека в качестве материала для поглощения iMG. С этой целью описано выделение синаптосом, полученных из человеческих i3ЛМН. Синаптосомы человека, полученные из i3LMN, помечены pH-чувствительным красителем, который позволяет количественно определять синаптосомы, локализованные в кислых компартментах во время обработки и деградации фагосом in vitro. Показан анализ фагоцитоза с использованием живоклеточной микроскопии для мониторинга динамического процесса поглощения микроглии в режиме реального времени. Этот функциональный анализ устанавливает основу для исследования возможных дефектов фагоцитоза микроглии в здоровье и болезни с использованием полной системы человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол дифференцировки, описанный здесь, обеспечивает эффективный метод получения микроглиоподобных клеток, полученных из iPSC, за ~ 6-8 недель с высокой чистотой и с достаточным выходом для проведения экспериментов по иммунофлуоресценции и других анализов, требующих большего количес?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Майкла Уорда за предоставление линии WTC11 hNIL iPSC для дифференцировки моторных нейронов и Лаборатории Джексона за поставку клона KOLF2.1J WT линии B03 iPSC, используемой для дифференцировки микроглии. Мы также благодарим Дороти Шафер за ее поддержку во время внедрения протоколов, Энтони Джампетруцци и Джона Ландерса за их помощь с системой визуализации живых клеток, а также Хейдена Гэдда за его технический вклад во время пересмотра и Джонатана Юнга за его сотрудничество в этом исследовании. Эта работа была поддержана Фондом неврологии Дэна и Дианы Риччио из Медицинской школы UMASS Chan и Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
