Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos
Summary
Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.
Abstract
A micróglia são as células imunes residentes de origem mielóide que mantêm a homeostase no microambiente cerebral e tornaram-se um jogador-chave em múltiplas doenças neurológicas. Estudar a micróglia humana na saúde e na doença representa um desafio devido ao suprimento extremamente limitado de células humanas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de indivíduos humanos podem ser usadas para contornar essa barreira. Aqui, é demonstrado como diferenciar iPSCs humanas em células semelhantes à micróglia (iMGs) para experimentação in vitro . Esses iMGs exibem as propriedades esperadas e fisiológicas da micróglia, incluindo morfologia semelhante à microglia, expressão de marcadores adequados e fagocitose ativa. Além disso, é fornecida documentação para isolar e marcar substratos de sinaptossomos derivados de neurônios motores inferiores derivados de iPSC humanos (i3LMNs). Um ensaio de imagem longitudinal de células vivas é usado para monitorar o engolfamento de sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH, permitindo investigações da capacidade fagocítica do iMG. Os protocolos aqui descritos são amplamente aplicáveis a diferentes campos que estão investigando a biologia da micróglia humana e a contribuição da micróglia para a doença.
Introduction
As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas 1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana 3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia5, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.
Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura 6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos 6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação “user-friendly” que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas12. Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia 7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.
A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada14. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i3LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i3são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método eficiente para obter células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC em ~6-8 semanas com alta pureza e em um rendimento suficiente para realizar experimentos de imunofluorescência e outros ensaios que requerem um maior número de células. Este protocolo produziu até 1 × 106 iMGs em 1 semana, o que permite a extração de proteínas e RNA e análises a jusante correspondentes (por exemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometria de m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Michael Ward por fornecer a linha WTC11 hNIL iPSC para diferenciação de neurônios motores e aos Jackson Laboratories por fornecer a linha KOLF2.1J WT clone B03 iPSC usada para diferenciação de micróglias. Também agradecemos a Dorothy Schafer por seu apoio durante a implementação dos protocolos, Anthony Giampetruzzi e John Landers por sua ajuda com o sistema de imagem de células vivas, bem como Hayden Gadd por suas contribuições técnicas durante as revisões e Jonathan Jung por sua colaboração neste estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience da UMASS Chan Medical School e pelo Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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