Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani
Summary
Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.
Abstract
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti di origine mieloide che mantengono l’omeostasi nel microambiente cerebrale e sono diventate un attore chiave in molteplici malattie neurologiche. Lo studio della microglia umana in salute e malattia rappresenta una sfida a causa della fornitura estremamente limitata di cellule umane. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da individui umani possono essere utilizzate per aggirare questa barriera. Qui, viene dimostrato come differenziare le iPSC umane in cellule simili alla microglia (iMG) per la sperimentazione in vitro . Queste iMG mostrano le proprietà attese e fisiologiche della microglia, compresa la morfologia simile alla microglia, l’espressione di marcatori appropriati e la fagocitosi attiva. Inoltre, viene fornita la documentazione per l’isolamento e l’etichettatura dei substrati di sinaptosomi derivati da motoneuroni inferiori derivati da iPSC umani (i3LMN). Un test di imaging longitudinale a cellule vive viene utilizzato per monitorare l’inghiottimento dei sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH, consentendo indagini sulla capacità fagocitaria di iMG. I protocolli qui descritti sono ampiamente applicabili a diversi campi che stanno studiando la biologia della microglia umana e il contributo della microglia alle malattie.
Introduction
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l’omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative 1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sottolineando la necessità di sviluppare tecnologie per studiare la genetica e le funzioni biologiche della microglia umana 3,4. L’isolamento della microglia dal tessuto primario sezionato può modificare gravemente le proprietà della microglia5, potenzialmente confondendo i risultati acquisiti con tali cellule. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di differenziare le iPSC umane in iMG, fornendo così un sistema di coltura cellulare per studiare la microglia umana in condizioni basali. Inoltre, un test di fagocitosi che utilizza un sistema modello completamente umano è incluso nel presente documento come mezzo per studiare la funzionalità delle iMG, sia come misura di controllo della qualità che per valutare la disfunzione di iMG nel contesto della malattia.
Protocolli multipli per la differenziazione delle microglia dalle iPSC sono recentemente emersi in letteratura 6,7,8,9,10. I potenziali svantaggi di alcuni protocolli includono lunghi o prolungati periodi di differenziazione, l’aggiunta di più fattori di crescita e/o procedure sperimentali complesse 6,9,10. Qui viene dimostrato un metodo di differenziazione “user-friendly” che ricapitola aspetti dell’ontogenesi della microglia attraverso la differenziazione di iPSCs in cellule precursori denominate precursori primitivi dei macrofagi (PMP)7,11. I PMP vengono generati come descritto in precedenza, con alcune ottimizzazioni presentate qui12. I PMP imitano i macrofagi derivati dal sacco vitellino indipendenti da MYB, che danno origine alla microglia durante lo sviluppo embrionale invadendo il cervello prima della chiusura della barriera emato-encefalica13. Per differenziare terminalmente i PMP in iMG, abbiamo utilizzato un metodo di monocoltura veloce e semplificato basato sui protocolli di Haenseler et al. e Brownjohn et al., con alcune modifiche per generare un efficiente metodo di differenziazione della microglia in cui le iMG esprimono robustamente marcatori arricchiti di microglia 7,8. Questo metodo di differenziazione può essere riprodotto in laboratori con esperienza nella coltura di iPSC e con obiettivi di ricerca volti a studiare la biologia delle microglia utilizzando un sistema modello umano.
Le microglia derivate da iPSC rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare le funzioni canoniche microgliali, compresa la fagocitosi. Le microglia sono i fagociti professionali del cervello e del SNC, dove eliminano i detriti cellulari, le proteine aggregate e la mielina degradata14. Le microglia funzionano anche nel rimodellamento sinaptico inghiottendo le sinapsi e nella difesa contro le infezioni esterne attraverso la fagocitosi dei patogeni15,16. In questo protocollo, la fagocitosi da parte di iMG viene valutata utilizzando sinaptosomi umani come materiale per l’inghiottimento di iMG. A tal fine, viene descritta una descrizione per isolare i sinaptosomi derivati da i3LMN umani. I sinaptosomi umani derivati da i3LMN sono marcati con un colorante sensibile al pH che consente la quantificazione dei sinaptosomi localizzati all’interno di compartimenti acidi durante l’elaborazione e la degradazione dei fagosomi in vitro. Viene mostrato un test di fagocitosi utilizzando la microscopia a cellule vive per monitorare il processo dinamico di inghiottimento della microglia in tempo reale. Questo test funzionale stabilisce una base per studiare possibili difetti nella fagocitosi microgliale in salute e malattia utilizzando un sistema umano completo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un metodo efficiente per ottenere cellule simili a microglia derivate da iPSC in ~ 6-8 settimane con elevata purezza e in una resa sufficiente per eseguire esperimenti di immunofluorescenza e altri test che richiedono un numero maggiore di cellule. Questo protocollo ha prodotto fino a 1 × 106 iMG in 1 settimana, il che consente l’estrazione di proteine e RNA e le corrispondenti analisi a valle (ad esempio, RNASeq, qRT-PCR, western blot, spettrometria di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Michael Ward per aver fornito la linea WTC11 hNIL iPSC per il differenziamento dei motoneuroni e i Jackson Laboratories per aver fornito la linea iPSC del clone KOLF2.1J WT B03 utilizzata per il differenziamento delle microglia. Ringraziamo anche Dorothy Schafer per il suo supporto durante l’implementazione dei protocolli, Anthony Giampetruzzi e John Landers per il loro aiuto con il sistema di imaging delle cellule vive, nonché Hayden Gadd per i suoi contributi tecnici durante le revisioni e Jonathan Jung per la sua collaborazione in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience della UMASS Chan Medical School e dall’Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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