תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.
Abstract
מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים ממוצא מיאלואידי המקיימים הומאוסטזיס במיקרו-סביבה של המוח והפכו לשחקן מפתח במחלות נוירולוגיות מרובות. חקר המיקרוגליה האנושית בבריאות ובמחלות מהווה אתגר בשל האספקה המוגבלת ביותר של תאים אנושיים. ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם באנשים אנושיים כדי לעקוף מחסום זה. כאן, הוא מדגים כיצד להתמיין תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים אנושיים לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs) לצורך ניסויים במבחנה . iMGs אלה מציגים את התכונות הצפויות והפיזיולוגיות של מיקרוגליה, כולל מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה, ביטוי של סמנים תקינים ופאגוציטוזה פעילה. בנוסף, מסופק תיעוד לבידוד ותיוג של מצעי סינפטוזום שמקורם בנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC אנושי (i3LMNs). בדיקת הדמיה אורכית של תאים חיים משמשת לניטור בליעה של סינפטוזומים אנושיים המסומנים בצבע רגיש ל-pH, ומאפשרת לחקור את היכולת הפאגוציטית של iMG. הפרוטוקולים המתוארים כאן ישימים באופן נרחב לתחומים שונים החוקרים את הביולוגיה של המיקרוגליה האנושית ואת תרומתה של המיקרוגליה למחלות.
Introduction
מיקרוגליה הם תאי מערכת החיסון המתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. מיקרוגליה חשובה גם במוח הבוגר לשמירה על הומאוסטזיס ולתגובה פעילה לתהליכי טראומה ומחלות. ראיות מצטברות מראות כי מיקרוגליה הם תורמים מרכזיים לפתוגנזה של מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות מרובות 1,2. אף על פי שהידע הנוכחי על ביולוגיה של מיקרוגליה נגזר בעיקר ממודלים של עכברים, מחקרים אחרונים הבהירו הבדלים חשובים בין מורין למיקרוגליה אנושית, והדגישו את הצורך בפיתוח טכנולוגיות לחקר הגנטיקה והתפקודים הביולוגיים של המיקרוגליה האנושית 3,4. בידוד של מיקרוגליה מרקמה ראשונית מנותקת יכול לשנות באופן חמור את תכונות המיקרוגליה5, מה שעלול לבלבל תוצאות שנרכשו עם תאים כאלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ל-iMGs, ובכך לספק מערכת תרבית תאים לחקר מיקרוגליה אנושית בתנאים בסיסיים. יתר על כן, בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מערכת מודל אנושית מלאה נכללת כאן כאמצעי לחקור את הפונקציונליות של iMGs, הן כמדד בקרת איכות והן כדי להעריך תפקוד לקוי של iMG בהקשר של מחלה.
פרוטוקולים מרובים להתמיינות מיקרוגליה מ- iPSCs הופיעו לאחרונה בספרות 6,7,8,9,10. חסרונות פוטנציאליים של פרוטוקולים מסוימים כוללים תקופות ממושכות או ארוכות של הבחנה, תוספת של גורמי גדילה מרובים ו / או הליכים ניסיוניים מורכבים 6,9,10. כאן מודגמת שיטת התמיינות “ידידותית למשתמש”, המשחזרת היבטים של מיקרוגליה אונטוגנית באמצעות התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים מקדימים המכונים מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)7,11. PMPs נוצרים כפי שתואר קודם לכן, עם כמה אופטימיזציות המוצגות כאן12. ה-PMPs מחקים מקרופאגים שמקורם בחלמון שאינו תלוי בחלמון, אשר מולידים מיקרוגליה במהלך ההתפתחות העוברית על ידי פלישה למוח לפני סגירת מחסום הדם-מוח13. כדי להבדיל באופן סופי בין PMPs ל-iMGs, השתמשנו בשיטת מונוקולטורה מהירה ופשוטה המבוססת על פרוטוקולים של Haenseler et al. ו-Brownjohn et al., עם כמה שינויים כדי ליצור שיטת בידול יעילה של מיקרוגליה, שבה iMGs מבטאים בחוזקה סמנים מועשרים במיקרוגליה 7,8. ניתן לשכפל שיטת בידול זו במעבדות עם מומחיות בתרבית של iPSCs ועם מטרות מחקר שמטרתן לחקור את הביולוגיה של מיקרוגליה באמצעות מערכת מודל אנושית.
מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, והם כלי חשוב לחקר תפקודים קנוניים של מיקרוגליה, כולל פאגוציטוזה. מיקרוגליה הם הפאגוציטים המקצועיים של המוח ושל מערכת העצבים המרכזית, שם הם מנקים פסולת תאים, חלבונים מצטברים ומיאלין14 פגום. מיקרוגליה מתפקדת גם בשיפוץ סינפטי על ידי בליעת סינפסות ובהגנה מפני זיהומים חיצוניים באמצעות פאגוציטוזה של פתוגנים15,16. בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה על ידי iMGs מוערכת באמצעות סינפטוזומים אנושיים כחומר לבליעת iMG. לשם כך מתואר תיאור לבידוד סינפטוזומים הנגזרים מ-i3LMNs אנושיים. הסינפטוזומים האנושיים שמקורם ב-i3LMN מסומנים בצבע רגיש ל-pH המאפשר כימות של סינפטוזומים הממוקמים בתוך מדורים חומציים במהלך עיבוד פגוזומים והשפלה במבחנה. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים מוצגת לניטור התהליך הדינמי של בליעת מיקרוגליה בזמן אמת. בדיקה תפקודית זו קובעת בסיס לחקור פגמים אפשריים בפאגוציטוזה מיקרוגליאלית בבריאות ובמחלות באמצעות מערכת אנושית שלמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה יעילה להשגת תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC תוך ~6-8 שבועות בטוהר גבוה ובתפוקה מספקת לביצוע ניסויים אימונופלואורסצנטיים ומבחנים אחרים הדורשים מספר גבוה יותר של תאים. פרוטוקול זה הניב עד 1 × 106 iMGs בשבוע אחד, המאפשר מיצוי חלבונים ורנ”א וניתוחים ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למייקל וורד על אספקת קו ה- iPSC של WTC11 hNIL להתמיינות נוירונים מוטוריים ולמעבדות ג’קסון על אספקת קו ה- KOLF2.1J WT clone B03 iPSC המשמש להבחנה במיקרוגליה. אנו מודים גם לדורותי שפר על תמיכתה במהלך יישום הפרוטוקולים, אנתוני גיאמפטרוצי וג’ון לנדרס על עזרתם במערכת ההדמיה של תאים חיים, כמו גם להיידן גאד על תרומתו הטכנית במהלך התיקונים ולג’ונתן יונג על שיתוף הפעולה שלו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן דן ודיאן ריצ’יו למדעי המוח מבית הספר לרפואה UMASS Chan וקרן אנג’ל בע”מ.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
