ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ
Summary
このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。
Abstract
ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。
Introduction
ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。
iPS細胞からのミクログリア分化のための複数のプロトコルが、最近、文献6、7、8、9、10に出現した。いくつかのプロトコルの潜在的な欠点には、長期間または長期間の分化、複数の成長因子の追加、および/または複雑な実験手順が含まれる6、9、10。ここでは、iPS細胞をプリミティブマクロファージ前駆体(PMP)と呼ばれる前駆細胞に分化させることで、ミクログリア個体発生の側面を再現する「ユーザーフレンドリーな」分化方法が実証されています7,11。PMPは、前述のように生成され、いくつかの最適化が本明細書12に提示される。PMPは、MYB非依存性の卵黄嚢由来のマクロファージを模倣しており、血液脳関門閉鎖の前に脳に侵入することにより、胚発生中にミクログリアを引き起こします13。PMPをiMGに最終的に分化させるために、HaenselerらとBrownjohnらのプロトコルに基づく高速で簡略化された単一培養法を使用し、iMGがミクログリア富化マーカーを堅牢に発現する効率的なミクログリア分化法を生成するためにいくつかの変更を加えました7,8。この分化法は、iPS細胞の培養に関する専門知識を持ち、ヒトモデルシステムを用いたミクログリア生物学の研究を目的とした研究目標を持つ研究室で再現することができます。
iPS細胞由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に関連する供給源であり、食作用を含むミクログリアの標準機能を調査するための重要なツールです。ミクログリアは、脳とCNSの専門的な食細胞であり、細胞の破片、凝集したタンパク質、および分解されたミエリンを取り除きます14。ミクログリアはまた、シナプスを飲み込むことによるシナプスリモデリングや、病原体の食作用による外部感染に対する防御にも機能します15,16。このプロトコルでは、iMGによる食作用は、iMG巻き込みの材料としてヒトシナプトソームを使用して評価されます。この目的のために、ヒトi3LMNsに由来するシナプトソームを単離するための記載が記載されている。i3LMN由来のヒトシナプトソームは、pH感受性色素で標識されており、in vitroでのファゴソーム処理および分解中に酸性コンパートメント内に局在するシナプトソームの定量を可能にします。ミクログリア巻き込みの動的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために、生細胞顕微鏡を用いた食作用アッセイが示されています。この機能アッセイは、完全なヒトシステムを使用して、健康と病気におけるミクログリア食作用の可能性のある欠陥を調査するための基礎を確立します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
