Humane mikroglia-lignende celler: Differentiering fra inducerede pluripotente stamceller og in vitro levende celle fagocytose assay ved hjælp af humane synaptosomer
Summary
Denne protokol beskriver differentieringsprocessen for humaninducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) i mikroglialignende celler til in vitro-eksperimenter . Vi inkluderer også en detaljeret procedure til generering af humane synaptosomer fra iPSC-afledte lavere motorneuroner, der kan bruges som substrat til in vitro-fagocytoseassays ved hjælp af levende cellebilleddannelsessystemer.
Abstract
Microglia er de hjemmehørende immunceller af myeloid oprindelse, der opretholder homeostase i hjernens mikromiljø og er blevet en nøglespiller i flere neurologiske sygdomme. At studere human microglia i sundhed og sygdom udgør en udfordring på grund af den ekstremt begrænsede forsyning af humane celler. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) afledt af menneskelige individer kan bruges til at omgå denne barriere. Her demonstreres det, hvordan man differentierer humane iPSC’er til microglia-lignende celler (iMG’er) til in vitro-eksperimenter . Disse iMG’er udviser de forventede og fysiologiske egenskaber ved microglia, herunder microglia-lignende morfologi, ekspression af korrekte markører og aktiv fagocytose. Derudover tilvejebringes dokumentation for isolering og mærkning af synaptosomsubstrater afledt af humane iPSC-afledte nedre motorneuroner (i3LMN’er). Et levende celle, langsgående billeddannelsesassay bruges til at overvåge opslugning af humane synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof, hvilket muliggør undersøgelser af iMG’s fagocytiske kapacitet. De protokoller, der er beskrevet heri, gælder bredt for forskellige områder, der undersøger human mikrogliabiologi og mikroglias bidrag til sygdom.
Introduction
Microglia er de hjemmehørende immunceller i centralnervesystemet (CNS) og spiller en afgørende rolle i udviklingen af CNS. Microglia er også vigtige i den voksne hjerne for at opretholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sygdomsprocesser. Kumulative beviser viser, at microglia er vigtige bidragydere til patogenesen af flere neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme 1,2. Selvom den nuværende viden om mikroglialbiologi overvejende er afledt af musemodeller, har nylige undersøgelser belyst vigtige forskelle mellem murine og human microglia, hvilket understreger behovet for at udvikle teknologier til at studere genetik og biologiske funktioner i human microglia 3,4. Isolering af microglia fra dissekeret primært væv kan alvorligt ændre microglia-egenskaber5, hvilket potentielt kan forvirre resultater erhvervet med sådanne celler. Det overordnede mål med denne metode er at differentiere humane iPSC’er til iMG’er og derved tilvejebringe et cellekultursystem til at studere human microglia under basale forhold. Desuden er en fagocytoseanalyse ved hjælp af et fuldt menneskeligt modelsystem inkluderet heri som et middel til at studere funktionaliteten af iMG’er, både som en kvalitetskontrolforanstaltning og til at vurdere iMG-dysfunktion i forbindelse med sygdom.
Flere protokoller til microglia-differentiering fra iPSC’er er for nylig dukket op i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentielle ulemper ved nogle protokoller inkluderer længere eller lange perioder med differentiering, tilføjelse af flere vækstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle procedurer 6,9,10. Her demonstreres en “brugervenlig” differentieringsmetode, der rekapitulerer aspekter af microglia ontogeni gennem differentiering af iPSC’er til forløberceller kaldet primitive makrofagprækursorer (PMP’er)7,11. PMP’er genereres som beskrevet tidligere, med nogle optimeringer præsenteret heri12. PMP’erne efterligner MYB-uafhængige æggeblomme-sac-afledte makrofager, som giver anledning til microglia under embryonal udvikling ved at invadere hjernen før blod-hjerne-barrierelukning13. For terminalt at differentiere PMP’er til iMG’er brugte vi en hurtig og forenklet monokulturmetode baseret på protokoller af Haenseler et al. og Brownjohn et al., med nogle ændringer for at generere en effektiv microglia-differentieringsmetode, hvor iMG’er robust udtrykker microglia-berigede markører 7,8. Denne differentieringsmetode kan gengives i laboratorier med ekspertise inden for iPSC-kulturen og med forskningsmål, der sigter mod at studere mikrogliabiologi ved hjælp af et menneskeligt modelsystem.
iPSC-afledt microglia repræsenterer en biologisk relevant kilde til human microglia til in vitro-eksperimenter og er et vigtigt redskab til at undersøge mikrogliale kanoniske funktioner, herunder fagocytose. Microglia er de professionelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleaffald, aggregerede proteiner og nedbrudt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygning ved at opsluge synapser og i forsvaret mod eksterne infektioner gennem fagocytose af patogener15,16. I denne protokol vurderes fagocytose ved iMG’er ved anvendelse af humane synaptosomer som materiale til iMG-opslugtning. Til dette formål beskrives en beskrivelse til isolering af synaptosomer afledt af human i3LMN’er. Dei 3LMN-afledte humane synaptosomer er mærket med et pH-følsomt farvestof, der muliggør kvantificering af synaptosomer lokaliseret i sure rum under fagosombehandling og nedbrydning in vitro. Et fagocytoseassay ved hjælp af levende cellemikroskopi er vist til overvågning af den dynamiske proces med microglia-opslugning i realtid. Dette funktionelle assay etablerer et grundlag for at undersøge mulige defekter i mikroglial fagocytose i sundhed og sygdom ved hjælp af et komplet humant system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Differentieringsprotokollen beskrevet her giver en effektiv metode til at opnå iPSC-afledte microglia-lignende celler i ~ 6-8 uger med høj renhed og i et tilstrækkeligt udbytte til at udføre immunfluorescensforsøg og andre assays, der kræver et højere antal celler. Denne protokol har givet op til 1 × 106 iMG’er på 1 uge, hvilket giver mulighed for protein- og RNA-ekstraktion og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrænsnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Michael Ward for at levere WTC11 hNIL iPSC-linjen til motorneurondifferentiering og Jackson Laboratories for at levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen, der bruges til mikroglia-differentiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hendes støtte under implementeringen af protokollerne, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjælp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisioner og Jonathan Jung for hans samarbejde i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
