カンジダ・アルビカンスに対するペプチドの抗真菌活性の定量化
Summary
このプロトコルは、カン ジダ・アルビカンスに対するペプチドおよび他の化合物(例えば、小分子抗真菌剤)の抗真菌活性に関する定量的データを得るための方法を記載する。増殖阻害を定量化するためにコロニー形成単位をカウントするのではなく、光学密度を使用することで、時間とリソースを節約できます。
Abstract
カン ジダ・アルビカンスの 抗真菌感受性試験を実施する従来の方法は時間がかかり、定量的な結果が得られません。たとえば、一般的なアプローチは、寒天プレート上で異なる濃度の抗真菌分子で処理された細胞をプレーティングし、コロニーをカウントして分子濃度と増殖阻害の関係を決定することに依存しています。この方法では、コロニーを数えるのに多くのプレートとかなりの時間が必要です。別の一般的なアプローチは、抗真菌剤で処理された培養物を視覚的に検査して成長を阻害するのに必要な最小濃度を特定することにより、プレートとコロニーのカウントを排除します。しかし、目視検査では定性的な結果しか得られず、亜阻害濃度での増殖に関する情報は失われます。このプロトコルは、抗真菌ペプチドに対する C.アルビカンスの 感受性を測定するための方法を記載している。培養物の光学密度測定に依存することにより、この方法は、異なるペプチド濃度での培養増殖に関する定量結果を得るために必要な時間と材料を削減します。真菌とペプチドとのインキュベーションは、適切なバッファーを使用して96ウェルプレートで行われ、コントロールは成長阻害なしおよび完全な成長阻害を表します。ペプチドとのインキュベーションに続いて、得られた細胞懸濁液を希釈してペプチド活性を低下させ、次いで一晩増殖させる。一晩増殖後、各ウェルの光学濃度を測定し、ポジティブおよびネガティブコントロールと比較して、各ペプチド濃度で得られた増殖阻害を計算する。このアッセイを使用した結果は、培養物を寒天プレートにプレーティングする従来の方法を使用した結果に匹敵しますが、このプロトコルにより、プラスチック廃棄物とコロニーのカウントに費やす時間が削減されます。このプロトコルのアプリケーションは抗真菌ペプチドに焦点を当てていますが、この方法は、既知または疑われる抗真菌活性を持つ他の分子の試験にも適用できます。
Introduction
カンジダ・アルビカンスは、口腔、皮膚、胃腸管、膣など、多くの場所にコロニーを形成するヒト微生物叢のメンバーです1。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)や免疫抑制治療などの疾患のために免疫不全の患者の場合、C.アルビカンスのコロニー形成は局所的または全身性カンジダ症につながる可能性があります2,3。アムホテリシンB、アゾール、またはエキノカンジンなどの現在利用可能な低分子抗真菌治療薬の使用は、溶解性および毒性の問題、ならびに治療薬に対する感染の耐性によって複雑になる可能性があります4,5。現在の抗真菌剤の限界のために、研究者はC.アルビカンスに対して活性を有する新しい抗真菌分子を継続的に探索している。
抗菌ペプチド(AMP)は、現在の低分子抗真菌剤6,7,8の潜在的な代替物であり、低分子薬物9と比較して耐性の発生の影響を受けにくいことが提案されています。AMPは多様なペプチドのセットですが、多くの場合陽イオンであり、幅広い活性スペクトルを持っています10、11、12。C.アルビカンスに対する活性を有するAMPには、ヒスタチンおよびセクロピンファミリー13,14,15の周知のペプチド、ならびにToAP2、NDBP-5.7、およびヒスタチン5変異体K11R-K17R16,17などのより最近記載されたペプチドが含まれる。カンジダ感染症の治療に潜在的であるため、C.アルビカンスを標的とする新しいAMPの同定と設計は、多くの研究グループにとって重要な目標です。
C.アルビカンスを標的とする効果的なAMP(および他の抗真菌剤)を開発するプロセスの一環として、有望なペプチドを同定するためにin vitro試験が一般的に使用されます。C. albicansに対する抗真菌活性を試験する方法は、通常、96ウェルプレート中でAMPの段階希釈(バッファーまたは培地中)で細胞をインキュベートすることを含みます。インキュベーション後の抗真菌活性を評価するためにいくつかの方法が利用可能です。臨床検査標準研究所によって記述された技術は、ウェルの濁度の純粋に視覚的評価を使用して、成長の完全な阻害(アゾールやエキノカンジンなどの選択された抗真菌剤の少なくとも50%阻害)の最小濃度(MIC)を決定し、サブMIC濃度での成長の定量化を提供しません18.別の一般的に使用されるアプローチでは、寒天プレート上にウェルの内容物をプレーティングし、プレートをインキュベートし、プレート上のコロニー形成単位(CFU)の数をカウントすることにより、AMPとのインキュベーション後の生存率を定量化します。この方法は、ヒスタチン5ベースのペプチド、LL-37、およびヒトラクトフェリン19、20、21を含む多数のペプチドを評価するために使用されています。この技術は、比較的大量の寒天と多数のプレートを必要とし、プレート上のCFUの面倒なカウントを伴います。プラスチック廃棄物の発生を減らし、CFUのカウントを回避しながら、より定量的なデータを取得するには、ウェルの内容物を使用して、別の96ウェルプレートに新鮮な培地を接種することができます。新たに接種したプレートをインキュベートした後、成長は、吸光度プレートリーダー上で600nm(OD600)における光学密度を測定することによって定量化することができる。この方法は、ヒスタチン5およびその分解断片ならびに細胞透過性ペプチド17、22、23、24、25の抗真菌活性を決定するために使用されている。
このプロトコルは、ペプチドの抗真菌活性を試験する方法を説明し、OD600 法を使用して、ペプチドによる C.アルビカンスの 生存率の低下を定量化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、真菌病原体 C.アルビカンスに対するAMPの抗真菌活性に関する定量的データを取得するための効率的なアプローチを説明しています。ペプチドやその他の抗真菌剤を試験するための一般的な代替アプローチの1つは、臨床検査標準研究所(CLSI)の標準M2718に記載されているブロス微量希釈ですが、この標準は定量的結果ではなく定性的な視覚的結果を得?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R03DE029270、T32AI089621B)、国立科学財団(CBET 1511718)、教育省(GAANN-P200A180093)、およびメリーランド大学クロスキャンパスシード助成金の支援を受けました。
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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